УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

  • От :
  • Категории : Без рубрики
На правах рукописи
уСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (ВНИИБТЖ). Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент

^

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Аликин Юрий Серафимович,

доктор ветеринарных наук, профессор

Луницын Василий Герасимович

Ведущая организация: ^

институт экспериментальной ветеринарии

им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ)

Защита состоится « 29 » ноября 2011 г. в «____» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» __________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Г.М. Стеблева

Актуальность темы. Туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место среди инфекционной патологии животных. Инфекция длительное время может протекать в латентной форме, не проявляя клинических признаков болезни, не влияя на продуктивность и жизнедеятельность животных. Быстро распространяясь среди поголовья животных, туберкулез искореняется с большим трудом.

В неблагополучных хозяйствах туберкулез крупного рогатого скота наносит значительный экономический ущерб владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей, организация мероприятий по борьбе с этим заболеванием была и остается актуальной проблемой. Против туберкулеза животных пока не разработано эффективных средств специфической профилактики и лечения. Поэтому, основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий является своевременная и качественная диагностика. Одним из основных диагностических подходов является обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом диагностическом материале (бронхиальные смывы, мокрота, моча, кровь, лимфатические узлы, кусочки паренхиматозных органов и др.). Наиболее эффективным методом выявления микобактерий на сегодняшний день является культуральный посев на питательные среды. Также в последнее время широкое развитие получил современный молекулярно-генетический метод – полимеразная цепная реакция (А.С. Донченко и др., 1994, 2004; В.И. Голышевская, 1995; Л.А. Таллер и др., 1995; В.Г. Ощепков и др., 2001, 2009; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов и др., 2002; Т.М. Shinnik, 1996). Выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала, в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя, связано с определенными трудностями – это медленный рост на искусственных питательных средах, способность к полиморфизму и длительной персистенции возбудителя в измененной форме (В.С. Федосеев, И.Н. Рубцова, А.Н. Байгазанов, 1988; О.А. Иртуганова, 2006). В связи с тем, что туберкулез в настоящее время остается огромной проблемой человечества, усовершенствование лабораторной диагностики, направленное на повышение чувствительности известных традиционных методов и сокращение сроков исследования, за счет модификации существующих и разработки новых способов диагностики этого заболевания, является актуальной задачей.

^ Целью настоящей работы было усовершенствовать методы выделения и идентификации микобактерий туберкулеза из биоматериала, взятого от животных.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

    1. Разработать питательную среду, позволяющую ускорить выделение и повысить высеваемость микобактерий туберкулеза из биоматериала от крупного рогатого скота.
  • Разработать метод ускоренного выявления микобактерий туберкулеза на основе комбинированного применения культурального метода и полимеразной цепной реакции.
  • ^Разработана плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат – 10%-ный водный экстракт полыни – для ускоренной изоляции типичных и измененных микобактерий туберкулеза, повышающая высеваемость микобактерий из биоматериала животных на 30%. Получен патент № 2382076 «Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза» от 20 февраля 2010 г. Впервые разработан комбинированный культурально-генетический метод (КГМ), основанный на исследовании «слепых» смывов с поверхности питательных сред в ранние сроки культивирования методом полимеразной цепной реакции. Предлагаемый метод позволяет дополнительно выявлять труднорастущие и некультивируемые формы микобактерий, при этом значительно сокращая сроки исследования до 3-5 суток.

    ^

    Повышение высеваемости микобактерий, выделенных из биоматериала от животных и сокращение сроков исследования, позволяет оперативно организовывать противотуберкулезные мероприятия в неблагополучных хозяйствах, а в случае исключения туберкулеза — предотвращать необоснованный убой здоровых животных. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций: «Комплекс ускоренной дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в благополучных хозяйствах», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 9 от 15.11.08; «Методы ускоренного выявления типичных и измененных (L-форм) микобактерий туберкулеза», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 5 от 30.09.10; Также материалы исследований использованы при проведении научно-исследовательской работы в ГНУ ВНИИБТЖ и учебном процессе Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.

    Апробация. Материалы исследований доложены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ г. Омск (2006-2010г.), координационных совещаниях ВИЭВ

    г. Москва (2006-2010г.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (2008, 2010г.), на заседаниях совета молодых ученых ВНИИБТЖ (2006-2011 г.), на межрегиональных научно-практических конференциях ВНИИБТЖ (2007-2010г.), на международной научной конференции молодых ученых, г. Новосибирск (2010г.). Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2011г.).

    ^ По материалам диссертации опубликовано 15 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринария и кормление», «Достижения науки и техники АПК»).

    ^ Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 13 рисунками. Библиографический список включает 223 источника, в том числе 31 – иностранных автора.

    Автор выражает искреннюю благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертационной работы и оказание научно-методической помощи кандидатам ветеринарных наук А.Д. Панкратовой и Е.Ю. Секину, а также сотрудникам лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом.

    ^

    1. Усовершенствованная плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат, для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза.
    2. Разработанный метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции.

    ^

    2.1 Материалы и методы исследований

    Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных (ГНУ ВНИИБТЖ) в лаборатории клеточной биотехнологии (2006-2008), в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом (2009-2010), часть исследований выполняли в лаборатории диагностических исследований и биотехнологии (2006-2009) в соответствии планом научно-исследовательских работ по заданию 08.01.04 «Создать систему иммунной защиты крупного рогатого скота от туберкулеза с применением молекулярных вакцин. Выявить молекулярно-генетические аспекты паразито-хозяинных отношений при туберкулезе животных и обосновать ускоренную диагностику с учетом изменчивости свойств возбудителя». Биологический материал для исследования отбирали в хозяйствах Омской и Новосибирской областей с различным эпизоотическим состоянием по туберкулезу животных, а также на мясокомбинате МПЗ «Компур» г. Омска и мясокомбинате г. Калачинска в период с 2006 по 2010 гг. Для проведения лабораторных исследований был отобран биологический материал: лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от 311 голов крупного рогатого скота, положительно реагировавших на ППД-туберкулин. Для эксперимента на лабораторных животных использовали 25 морских свинок.

    Кроме этого, для исследования использованы коллекционные, официально зарегистрированные штаммы культур: M.bovis шт.8, M.avium шт.9 (получены в 1986 году в Государственном научно-контрольном институте), а также M.bovis шт.14, M.intracellulare (получены в 1986 году в лаборатории специфической профилактики туберкулеза ВНИИБТЖ).

    Бактериологические исследования, включающие бактериоскопический метод, культуральный посев, биопробу на лабораторных животных проводили в соответствии с нормативно-технической документацией. Предпосевную обработку биологического материала от лабораторных животных и крупного рогатого скота проводили по методу Гона в модификации Левенштейна-Сумиоши. Для сокращения сроков выделения микобактерий из биологического материала от животных нами сконструированы 4 варианта питательных сред с использованием биологически активных добавок растительного происхождения. За основу взяты стандартные плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л, как наиболее часто используемые в бактериологической диагностике туберкулеза. В качестве ростостимулирующих добавок изучали 10%-ный водный экстракт полыни и 10%-ный водный экстракт «Лив-52». Бактериоскопические исследования проводили по методу Циль-Нильсена с оценкой результатов в визуализированной системе с фотодокументированием Axiostar plus Carl Zeiss. Результаты обработаны в программе Axiovision Rel 4.7. Всего исследовано 1200 мазков. Видовую идентификацию выделенных культур проводили общепринятыми культурально-биохимическими методами (Наставление по диагностике туберкулеза, 2002). В необходимых случаях, проводили биологическую пробу на морских свинках (всего использовано 98 голов). Нами проведены исследования по разработке культурально-генетического метода, основанного на сочетании культурального посева на модифицированные питательные среды и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы «МТБ-КОМ» производства НИИ Эпидемиологии, г. Москва. Материалом для исследования в ПЦР служили смывы с поверхности питательных сред на 3, 5, 10, 17 сутки культивирования, без видимого роста бактериальных культур. Всего исследовано 327 смывов.

    Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis complex проводили методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. ПЦР-амплификацию проводили на приборе «Ampli-4» производства «ДНК-Технология», Россия.

    Экспериментальные данные обработаны методами математической статистики с использованием критериев Стьюдента, средние значения (M±m), достоверность разницы опытных и контрольных показателей (Р) определены с помощью программы Microsoft Excel. Подробно схемы опытов, методы и методики исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.

    2.2 ^

Комментариев нет

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Планы мероприятий
Игра викторина по ЭКОЛОГИИ-10 класс

  Цель игры «Викторина по экологии» : углубить экологические знания Весь класс разбит на четыре команды по 6 человек. Время обдумывания ответа -1 минута. Ведущий читает высказывания великих людей с паузами , там , где пропущены слова. Команды должны вставить эти слова «Оценивать … только по стоимости её материальных богатств- …

Задания
Хирургия и Реаниматология. Тесты. Методическое пособие

Тестовые задания. Хирургия и Реаниматология.   Профилактика хирургической инфекции. Инфекционная безопасность в работе фельдшера   Обезболивание   Кровотечение и гемостаз   Переливание крови и кровозаменителей, инфузионная терапия   Десмургия   Ведение больных в полеоперационном периоде   Синдром повреждения. Открытые повреждения мягких тканей. Механические повреждения костей, суставов и внутренних органов   …

Планы занятий
Профориентационный тест Л.А. Йовайши на определение склонности человека к тому или иному роду деятельности

ПРОФЕССИЯ – это вид трудовой деятельности человека, который требует определенного уровня знаний, специальных умений, подготовки человека и при этом служит источником дохода. Профессиональная принадлежность – одна из важнейших социальных ролей человека так как, выбирая профессию, человек выбирает себе не только работу, но и определенные нормы, жизненные ценности и образ жизни, …