2.3 Методы обследования больных — Антитела к helicobacter pylori и поражения желудка при хроническом панкреатите

  • От :
  • Категории : Без рубрики

^ URE-НР test (фирмы PLIVA-LACHEMA, Брно, Чехия).Набор URE-НР test предназначен для быстрого выявления Helicobacter pylori в биоптатах. Выявление Н. pylori основано на ферментативном гидролизе уреазы (сильная уреазная активность – характерное свойство Н. pylori). Для подтверждения диагноза требуется положительный результат выделения культуры либо данные микроскопии. Тест помещен в 8 луночные стрипы микротитровальной пластинки. Набор содержит 3 пластинки и позволяет провести 288 (96х3) определений. Интерпретация реакции представлена на рисунке 2.3.
Реакция
+
Цвет
положительная
красный
отрицательная
желтый
Рисунок 2.3 Интерпретация реакции URE-НР test.Биохимический метод (непрямой инвазивный метод) является наиболее востребованным в практической медицине и основан на присущей Нр высокой активности уреазных ферментов, в 100 раз превышающей таковую у других уреазопозитивных бактерий (вследствие чего носит название «уреазного теста»). Метод прост в использовании, не требует дополнительных исследований и позволяет с достаточно высокой точностью идентифицировать Нр по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды теста аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины теста микробной уреазой (рис 2.3). В качестве индикатора служит феноловый красный, который изменяет свой цвет с желтого в кислой среде на красный в щелочной. Время срабатывания теста от 5 мин до 3 часов. Специфичность и чувствительность теста зависит от степени обсемененности исследуемого биоптата, сроков хранения и приема антисекреторных препаратов.Основным недостатком уреазных тестов является их непрямая сущность, то ест выявление не бактерий как таковых. А лишь их уреазной активности. При невысокой обсемененности суммарная уреазная активность может быть очень низкой. Что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того, существуют и уреазонегативные штаммы Нр, для которых уреазные тесты непригодны.
^
Гистологический метод, прежде всего, позволяет оценить характер патологического процесса в слизистых оболочках верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Наличие, выраженность и активность воспаления, развитие атрофии и кишечной метаплазии. Главным достоинством этого метода является возможность помимо оценки патологического процесса обнаружить бактерии Нр и наблюдать их взаимоотношение с поверхность клеточных элементов слизистой желудка.Гистологическая оценка биоптатов проводилась при помощи световой микроскопии.Кусочки слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, полученные при прицельной биопсии, фиксировали в 10% нейтральном формалине, забуференном по Лили. После фиксации заливали в парафин и получали срезы толщиной 5 мкм.Для оценки общепатологических изменений слизистой оболочки парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, выраженность и активность воспалительного процесса в СО устанавливали по интенсивности лимфоплазмоцитарной инфильтрации и присутствию в ней нейтрофильного (гранулоцитарного) компонента, используя для объективной оценки результатов визуально-аналоговую шкалу морфологических изменений СО [92]. Диагноз хронического гастрита ставился в соответствии с международной классификацией (модификация Сиднейской системы).Для верификации Helicobacter pylori элективную окраску срезов проводили при помощи реактива Гимзы (фирма «Мерк»). Оценку Helicobacter pylori. – обсемененность слизистой оболочки проводили согласно методике предложенной Л.И. Аруином и соавт., (1995), представленной в таблице 2.2. Таблица 2.2 Оценка степени обсемененности слизистой оболочки Helicobacter pylori
Степень обсемененности
Количество микробных тел
Слабая степень (+)
До 20 микробных тел в поле зрения
Средняя степень (++)
До 50 микробных тел в поле зрения
Высокая степень (+++)
Более 50 микробных тел в поле зрения
Учитывалось расположение микробных тел: на поверхности слизистой оболочки, в глубине ямок, адгезия.
^
В исследуемой группе больных иммунологические показатели изучались в сыворотке крови больных.Натощак после пункции локтевой вены проводилось взятие 10 мл крови в центрифужную пробирку. Для получения сыворотки проводилось центрифугирование в течение 10-15 мин при 1500 об/мин. Полученная сыворотка замораживалась при t˚ = – 40˚С.Сроки определения иммунологических показателей в сыворотке крови:• при поступлении в стационар на фоне обострения заболевания;• по окончании терапии, на ≈ 20 сутки пребывания в стационаре;• через 12 недель после окончания курса лечения.В сыворотке крови больных уровень основных классов иммуноглобулинов: Ig M, IgG, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии (G. Mancini et al., 1965).Серологический метод диагностики основан на обнаружении антител различных классов (Ig M, IgG, IgA), образовавшихся в крови больного в ответ на инфекцию Helicobacter pylori.Определение антител проводилось с помощью иммуноферментного анализа.
^
В настоящей работе использовались тест-системы «ХеликоБест-антитела» ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск).
Суммарные (IgM, IgG, IgA) антитела к Саg А антигену Нр выявлялись в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбированы рекомбинантные антигены Нр. В используемые лунки вносятся контроли и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:10), при инкубации иммобилизованным сорбентом улавливаются специфические антитела разных классов иммуноглобулинов, присутствующие в образце. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – рекомбинантный Cag A белок – в комплексе с пероксидазой хрена. Повторная промывка удаляет несвязанный конъгат. В результате образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому раствор хромогена (ТМБ с ЦФР) происходит специфическое окрашивание. Внесение стоп-реагента способствует изменению окраски и остановки реакции. Результаты твердой модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм ОПкрит по формуле:
ОПкрит = ОПср К– + 0.2,
где – ОПср К– – среднее значение оптической плотности К–.
Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контроль. Возможны 12 независимых постановок ИФА, при каждой из которой 3 лунки используют для постановки контролей. Таблица 2.3 Интерпретация результатов
Оптическая плотность сыворотки
Результат
Титр антител
От 0 до (ОПкрит –0.05)
отрицательный
менее 1:5
От (ОПкрит-0.05) до (ОПкрит +0.05)
сомнительный*
1:5
От (ОПкрит +0.05) до 2× ОПкрит
слабоположительный
1:10
От 2× ОПкрит до 3× ОПкрит
положительный
1:20
От 3× ОПкрит до 6× ОПкрит
сильноположительный
1:40
От 6× ОПкрит до 9× ОПкрит
сильноположительный
1:80
От 9× ОПкрит до 11× ОПкрит
сильноположительный
1:160
Примечание. Сыворотки с результатом «сомнительный*» исследовались повторно, согласно рекомендации фирмы производителя.Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались.
^
В настоящей работе использовались тест-системы «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA (IgG)», Эко-Лаб (г. Элекрогорск).
Выявлялись специфические антитела класса IgG, IgA к очищенным антигенам Нр в сыворотке крови методом двухстадийного непрямого иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбирован очищенный антиген Нр. В используемые лунки вносят контрольные сыворотки (К+ – титр 1:400, К–, Кпор – титр 1:100) и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:101), при инкубации, присутствующие в образце антихеликобактерные IgA (IgG) антитела связываются с иммобилизованным антигеном. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – специфические антитела к IgA-Нр (IgG-Нр) человека, меченные пероксидазой хрена. Несвязавшийся конъюгат удаляется путем промывки. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином (ТМБ), в результате которой меняется окрашивание в лунке планшета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации специфических антител класса IgA (IgG) к Нр, внесение стоп-реагента меняет цвет и останавливает реакцию. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм, с последующим расчетом пороговой ОП(пор) [ОПпор = ОП (Кпор) + ОП (К-)] и количественной оценкой результатов по выстроенной калибровочной кривой. Интерпретация результатов представлена в таблице 2.4.
Таблица 2.4 Определение титра видоспецифических антител к Нр и качественная оценка результата по оптической плотности сыворотки
Оптическая плотностьконтрольных сывороток
Результат
Титр антител
ОП К– не выше 0.10
отрицательный

ОП К+ не выше 0.60
положительный
1:400
ОП Кпор не ниже 0.20*
пороговый
1:400
Примечание. Исследуемые образцы учитываются как «положительные» при ОП ≥ ОПпор, как «отрицательные» при ОП < ОПпор Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались. ^ Накопление и обработка данных производилась с использованием программы МS Excel (Microsoft Office XP Professional, 2002). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием Statsoft «Statistika 5.5» USA. Оценивая вид распределения: для описания выборочного нормального распределения признака вычисляется среднее значение, среднее квадратичное отклонение (СКО), для выборочного негауссова распределения – медиана и интерквартильный размах. Исследуемые группы являлись зависимыми (связанными), для сравнения использовались параметрический метод – t-критерий Стьюдента – (в случае нормального распределения признака) и непараметрический – критерий Вилкоксона – в случае, когда анализируемый признак является количественным, но хотя бы в одной из выборок его распределение не является нормальным. Различия считались значимыми, при уровне вероятности р ^ URE-НР test (фирмы PLIVA-LACHEMA, Брно, Чехия).Набор URE-НР test предназначен для быстрого выявления Helicobacter pylori в биоптатах. Выявление Н. pylori основано на ферментативном гидролизе уреазы (сильная уреазная активность – характерное свойство Н. pylori). Для подтверждения диагноза требуется положительный результат выделения культуры либо данные микроскопии. Тест помещен в 8 луночные стрипы микротитровальной пластинки. Набор содержит 3 пластинки и позволяет провести 288 (96х3) определений. Интерпретация реакции представлена на рисунке 2.3.

Реакция + Цвет
положительная красный
отрицательная желтый


Рисунок 2.3 Интерпретация реакции URE-НР test.Биохимический метод (непрямой инвазивный метод) является наиболее востребованным в практической медицине и основан на присущей Нр высокой активности уреазных ферментов, в 100 раз превышающей таковую у других уреазопозитивных бактерий (вследствие чего носит название «уреазного теста»). Метод прост в использовании, не требует дополнительных исследований и позволяет с достаточно высокой точностью идентифицировать Нр по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды теста аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины теста микробной уреазой (рис 2.3). В качестве индикатора служит феноловый красный, который изменяет свой цвет с желтого в кислой среде на красный в щелочной. Время срабатывания теста от 5 мин до 3 часов. Специфичность и чувствительность теста зависит от степени обсемененности исследуемого биоптата, сроков хранения и приема антисекреторных препаратов.Основным недостатком уреазных тестов является их непрямая сущность, то ест выявление не бактерий как таковых. А лишь их уреазной активности. При невысокой обсемененности суммарная уреазная активность может быть очень низкой. Что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того, существуют и уреазонегативные штаммы Нр, для которых уреазные тесты непригодны.

^

Гистологический метод, прежде всего, позволяет оценить характер патологического процесса в слизистых оболочках верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Наличие, выраженность и активность воспаления, развитие атрофии и кишечной метаплазии. Главным достоинством этого метода является возможность помимо оценки патологического процесса обнаружить бактерии Нр и наблюдать их взаимоотношение с поверхность клеточных элементов слизистой желудка.Гистологическая оценка биоптатов проводилась при помощи световой микроскопии.Кусочки слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, полученные при прицельной биопсии, фиксировали в 10% нейтральном формалине, забуференном по Лили. После фиксации заливали в парафин и получали срезы толщиной 5 мкм.Для оценки общепатологических изменений слизистой оболочки парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, выраженность и активность воспалительного процесса в СО устанавливали по интенсивности лимфоплазмоцитарной инфильтрации и присутствию в ней нейтрофильного (гранулоцитарного) компонента, используя для объективной оценки результатов визуально-аналоговую шкалу морфологических изменений СО [92]. Диагноз хронического гастрита ставился в соответствии с международной классификацией (модификация Сиднейской системы).Для верификации Helicobacter pylori элективную окраску срезов проводили при помощи реактива Гимзы (фирма «Мерк»). Оценку Helicobacter pylori. – обсемененность слизистой оболочки проводили согласно методике предложенной Л.И. Аруином и соавт., (1995), представленной в таблице 2.2. Таблица 2.2 Оценка степени обсемененности слизистой оболочки Helicobacter pylori

Степень обсемененности Количество микробных тел
Слабая степень (+) До 20 микробных тел в поле зрения
Средняя степень (++) До 50 микробных тел в поле зрения
Высокая степень (+++) Более 50 микробных тел в поле зрения


Учитывалось расположение микробных тел: на поверхности слизистой оболочки, в глубине ямок, адгезия.

^

В исследуемой группе больных иммунологические показатели изучались в сыворотке крови больных.Натощак после пункции локтевой вены проводилось взятие 10 мл крови в центрифужную пробирку. Для получения сыворотки проводилось центрифугирование в течение 10-15 мин при 1500 об/мин. Полученная сыворотка замораживалась при t˚ = – 40˚С.Сроки определения иммунологических показателей в сыворотке крови:• при поступлении в стационар на фоне обострения заболевания;• по окончании терапии, на ≈ 20 сутки пребывания в стационаре;• через 12 недель после окончания курса лечения.В сыворотке крови больных уровень основных классов иммуноглобулинов: Ig M, IgG, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии (G. Mancini et al., 1965).Серологический метод диагностики основан на обнаружении антител различных классов (Ig M, IgG, IgA), образовавшихся в крови больного в ответ на инфекцию Helicobacter pylori.Определение антител проводилось с помощью иммуноферментного анализа.

^

В настоящей работе использовались тест-системы «ХеликоБест-антитела» ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск).

Суммарные (IgM, IgG, IgA) антитела к Саg А антигену Нр выявлялись в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбированы рекомбинантные антигены Нр. В используемые лунки вносятся контроли и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:10), при инкубации иммобилизованным сорбентом улавливаются специфические антитела разных классов иммуноглобулинов, присутствующие в образце. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – рекомбинантный Cag A белок – в комплексе с пероксидазой хрена. Повторная промывка удаляет несвязанный конъгат. В результате образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому раствор хромогена (ТМБ с ЦФР) происходит специфическое окрашивание. Внесение стоп-реагента способствует изменению окраски и остановки реакции. Результаты твердой модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм ОПкрит по формуле:

ОПкрит = ОПср К + 0.2,

где – ОПср К – среднее значение оптической плотности К.

Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контроль. Возможны 12 независимых постановок ИФА, при каждой из которой 3 лунки используют для постановки контролей. Таблица 2.3 Интерпретация результатов

Оптическая плотность сыворотки Результат Титр антител
От 0 до (ОПкрит –0.05) отрицательный менее 1:5
От (ОПкрит-0.05) до (ОПкрит +0.05) сомнительный* 1:5
От (ОПкрит +0.05) до 2× ОПкрит слабоположительный 1:10
От 2× ОПкрит до 3× ОПкрит положительный 1:20
От 3× ОПкрит до 6× ОПкрит сильноположительный 1:40
От 6× ОПкрит до 9× ОПкрит сильноположительный 1:80
От 9× ОПкрит до 11× ОПкрит сильноположительный 1:160


Примечание. Сыворотки с результатом «сомнительный*» исследовались повторно, согласно рекомендации фирмы производителя.Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались.

^

В настоящей работе использовались тест-системы «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA (IgG)», Эко-Лаб (г. Элекрогорск).

Выявлялись специфические антитела класса IgG, IgA к очищенным антигенам Нр в сыворотке крови методом двухстадийного непрямого иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбирован очищенный антиген Нр. В используемые лунки вносят контрольные сыворотки (К+ – титр 1:400, К, Кпор – титр 1:100) и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:101), при инкубации, присутствующие в образце антихеликобактерные IgA (IgG) антитела связываются с иммобилизованным антигеном. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – специфические антитела к IgA-Нр (IgG-Нр) человека, меченные пероксидазой хрена. Несвязавшийся конъюгат удаляется путем промывки. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином (ТМБ), в результате которой меняется окрашивание в лунке планшета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации специфических антител класса IgA (IgG) к Нр, внесение стоп-реагента меняет цвет и останавливает реакцию. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм, с последующим расчетом пороговой ОП(пор) [ОПпор = ОП (Кпор) + ОП (К)] и количественной оценкой результатов по выстроенной калибровочной кривой. Интерпретация результатов представлена в таблице 2.4.

Таблица 2.4 Определение титра видоспецифических антител к Нр и качественная оценка результата по оптической плотности сыворотки

Оптическая плотностьконтрольных сывороток Результат Титр антител
ОП К не выше 0.10 отрицательный
ОП К+ не выше 0.60 положительный 1:400
ОП Кпор не ниже 0.20* пороговый 1:400

Примечание. Исследуемые образцы учитываются как «положительные» при ОП ≥ ОПпор, как «отрицательные» при ОП < ОПпор

Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались.

^

Накопление и обработка данных производилась с использованием программы МS Excel (Microsoft Office XP Professional, 2002). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием Statsoft «Statistika 5.5» USA. Оценивая вид распределения: для описания выборочного нормального распределения признака вычисляется среднее значение, среднее квадратичное отклонение (СКО), для выборочного негауссова распределения – медиана и интерквартильный размах. Исследуемые группы являлись зависимыми (связанными), для сравнения использовались параметрический метод – t-критерий Стьюдента – (в случае нормального распределения признака) и непараметрический – критерий Вилкоксона – в случае, когда анализируемый признак является количественным, но хотя бы в одной из выборок его распределение не является нормальным. Различия считались значимыми, при уровне вероятности р

образовавшийся комплекс антиген-антитело-конъюгат выявляется,среднее значение оптической плотности,степени обсемененности исследуемого биоптата,кусочки слизистой оболочки тела,обнаружении антител различных классов,набор ure-нр test предназначен,интерпретация реакции ure-нр test,получали срезы толщиной мкм,гистологическая оценка биоптатов проводилась,быстрого выявления helicobacter pylori

Комментариев нет

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Планы мероприятий
Игра викторина по ЭКОЛОГИИ-10 класс

  Цель игры «Викторина по экологии» : углубить экологические знания Весь класс разбит на четыре команды по 6 человек. Время обдумывания ответа -1 минута. Ведущий читает высказывания великих людей с паузами , там , где пропущены слова. Команды должны вставить эти слова «Оценивать … только по стоимости её материальных богатств- …

Задания
Хирургия и Реаниматология. Тесты. Методическое пособие

Тестовые задания. Хирургия и Реаниматология.   Профилактика хирургической инфекции. Инфекционная безопасность в работе фельдшера   Обезболивание   Кровотечение и гемостаз   Переливание крови и кровозаменителей, инфузионная терапия   Десмургия   Ведение больных в полеоперационном периоде   Синдром повреждения. Открытые повреждения мягких тканей. Механические повреждения костей, суставов и внутренних органов   …

Планы занятий
Профориентационный тест Л.А. Йовайши на определение склонности человека к тому или иному роду деятельности

ПРОФЕССИЯ – это вид трудовой деятельности человека, который требует определенного уровня знаний, специальных умений, подготовки человека и при этом служит источником дохода. Профессиональная принадлежность – одна из важнейших социальных ролей человека так как, выбирая профессию, человек выбирает себе не только работу, но и определенные нормы, жизненные ценности и образ жизни, …