Целуйко С. С., Зиновьев С. В




Скачать 0.9 Mb.
Название Целуйко С. С., Зиновьев С. В
страница 2/6
Дата публикации 09.06.2015
Размер 0.9 Mb.
Тип Документы
edushk.ru > Биология > Документы
1   2   3   4   5   6

Методы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме.

^ Метод выявления: ионов неорганического железа в легких.

Реактивы:

1)    а) 1% раствор желтой кровяной соли-реакция берлинской лазури –обнаружение трехвалентного железа; б) 1% раствор красной кровяной соли –реакция турнбулевой сини- обнаружение двухвалентного железа

2)     0,1 н. раствор соляной кислоты (8,2 мл концентрированной соляной кислоты  развести дистиллированной водой до 1 л.)

Ход окраски:

1)     Тонкие кусочки легких (фиксированные в формалине) сразу после быстрой отмывки во влажном виде помещают в смесь равных частей а) раствора соляной кислоты и б) раствора красной кровяной соли или б) желтой кровяной соли.

2)     Бюкс или пенициллиновый пузырек с указанной смесью и кусочком легких держат в водяной бане или термостате при температуре  50-560 С  в течение суток (ну там будет эмпирика конечно).

3)     После окрашивания кусочки, промываются сначала 0,1 н. раствор соляной кислоты, а затем в дистиллированной воде в течение нескольких часов

4)     После промывания из тонких кусочков легких на замораживающем микротоме изготавливаются криостатные срезы. После тщательной промывки реакция окрашивания прекращается, в то же время, учитывая, что следует при очень низкой температуре криостата (от минус 200 С, до минус 400 С), что с нашей точки зрения полностью препятствует взаимодействию остатков реактива гексацианоферрата калия с поверхностью ножа.  Докрашивать эти срезы нет необходимости, поскольку гексацианферраты способны диффузно окрашивать клетки при таком режиме.

^ Метод выявления ионов неорганического железа: на мазках крови, назального, орального секрета фиксированных в парах формалина.

Реактивы:      а) 1% раствор желтой кровяной соли-реакция берлинской лазури –обнаружение трехвалентного железа; б) 1% раствор красной кровяной соли –реакция турнбулевой сини- обнаружение двухвалентного железа

2)     0,1 н. раствор соляной кислоты (8,2 мл концентрированной соляной кислоты  развести дистиллированной водой до 1 л.).

Ход окраски: на мазках крови, назального, орального секрета фиксированных в парах формалина помещают в реактив 1 или 2 на 10 минут при температуре  50-560 С. В случае необходимости мазки подкрашивают сафранином или основным фуксином.

^ Гистохимические методы окрашивания раствором азотнокислого серебра клеток и тканей легких, периферической крови.

а) Метод фон Косса (по Culling C. F. A. 1974, Пирс Э.1962)

Реактивы:

1) 5% р-р Нитрата серебра в дистиллированной воде.
2) 5% р-р Натрия тиосульфат 5 г в дистиллированной воде.
Ход методики: 5 мкм парафиновых срезах нейтральной буферной фиксированных формалином тканей подходит. Другие фиксаторов, вероятно, будут удовлетворительными, хотя те, которые содержат сильные кислоты, может удалить некоторые отложения кальция ..
1. Принесите срезы дистиллированной воды через ксилол и этанол.
Поместите разделы квартиры на подходящую опору (стеклянные палочки в чашку Петри).
3. Окрашивание раствором серебра.
4. Необходимо подвергать срезы воздействию сильных, прямых солнечных лучей в течение 15-60 минут. Если это невозможно, необходимо использовать ультрафиолетовый свет на расстоянии около 5 см. (По данным Лили метод фон Косса для окрашивания костной ткани продолжается в течение 24 часов).

5. Препараты необходимо промыть дистиллированной водой, чтобы удалить все следы нитрата серебра.
6. Промывка материала в тиосульфате в течение 5 минут.
7. Затем промывка препаратов с проточной водой в течение 5 минут.
8. Контрастирующая окраска препаратов проводится нейтральным красным.
9. Проводка через спирты, ксилол, заливка в кедровый бальзам.
Примечания
1. Время воздействия света можно определить визуально. Раствор серебра может быть удален, когда депозиты кальция будут отчетливо черные.
2. Для повышения уверенности, почерневшие материала кальция, повторяющийся раздел можно дифференцировать с 0,5% водным раствором соляной кислоты в течение нескольких минут..
3. Для удаления кальция Пирс рекомендует 0,1 н. цитратный буфера рН 4,5 применяется в течение 20 минут для этих целей.
Суправитальное окрашивание спирт-ацетатном растворе азотнокислого серебра криостатных срезов легких по методу N. J. Chinoy1969.

Реактивы: 5 % р-р азотнокислого серебра в спирт-ацетате. К 80 мл 96 этиловому спирт добавляется 20 мл ледяной уксусная кислота, 5 гр. нитрата серебра, учитывая, что этиловый спирт легче воды получается 70% раствор этанола. Нитрат серебра плохо растворяется в спирт-этаноле, поэтому полученный раствор тщательно размешивается, без нагревания, сразу используется для проведения гистохимической реакции. Лабораторная посуда тщательно промывается в горячем хромпике.

Этапы окрашивания

Тонкие кусочки легких экспериментальных животных без фиксации помещаются на 24 часа в спирт-ацетатный р-р нитрата серебра. Окрашивание проходит при температуре 50 С.

После окрашивания кусочки легких быстро промываются в дестилированной воде. Затем кусочки легких в течение двух часов промываются в растворе гипосульфите. После изготовления криостатные срезы прикрепляются на предметные стекла, покрытые желатиной. После высыхания препараты повторно промываются в гипосульфите натрия.

Затем быстро промываются в спирт – ацетате без нитрата серебра. После высыхания препаратов, срезы заключаются в канадский бальзам, и на них наносятся предметные стекла.

^ Метод окрашивания в спирт-ацетатном растворе азотнокислого серебра мазков периферической крови, фиксированные в течение 20 минут в парах формалина (ЦНИЛ АГМА).

Ход методики: Используются толстые мазки периферической крови. Реакция проводится сразу после фиксации в парах формалина. На мазки наноситься спирт-ацетатный р-р нитрата серебра. Окрашивание проводится в течение одного часа при температуре 40 С.

После окрашивания мазки периферической крови быстро промываются в дистиллированной воде. Затем мазки крови в течение 20 минут промываются в растворе гипосульфите. Затем быстро промываются в спирт – ацетате без нитрата серебра. Следующий этап заключается в быстром (5-10 секунд) окрашивании мазков в р-ре Азур -2 по Нохту (1:1000), которые так же быстро ополаскиваются в дистиллированной воде. Сразу после высыхания, препараты микроскопируют под иммерсионным объективом, срезы заключаются в канадский бальзам, и на них наносятся предметные стекла.

Методы исследования окислительного стресса с помощью гистохимического окрашивания в клетках кровеносных сосудов респираторного отдела легких ионов кальция, железа и др. микроэлементов ализариновым красным С.

^ А) Методы гистохимического окрашивания клеток и тканей организма ализариновым красным С.

А) Окрашивание костной ткани ализариновым красным С (по Лили Р., 1969)

Этом метод является классическим доказательством того, что ализариновый красный С окрашивает соли неорганического кальция, который сохранил свое значение и сейчас. Экспериментальным животным дважды в неделю внутрибрюшинно вводится раствор ализаринового красного С, из расчета 200 мг на кг. После двух-трех недельного курса инъекций кости окрашиваются в красный цвет.

^ Окрашивание ализариновым красным С по Мак Ги Расселу (Dahl,s) по (Лупа 1978, Саркисову Л.С. 1996).

Реактивы: в 2% раствор ализаринового красного С добавляют слабый раствор аммиака – 1:100, доводя рН до 4,1-4,3.

1. Материал фиксируют в формалине или формалин-этаноле, заливают в парафин

2. Депарафинированные срезы помещают в 50% спирт

3. Быстро промывают дистиллированной водой

4. Под контролем микроскопии окрашивают ализариновым красным С в течение 30 с .- 5 мин.

5. Срезы без промывания подсушивают фильтровальной бумагой

6. помещают в абсолютный ацетон на 10-20 с.

Метод окрашивания клеток ализарином синим (Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. 1957).

Реактивы: Растворяют 10 г сернокислого алюминия в 100 см.3 воды; при кипячении добавляют 0,5 г кислого ализаринового синего и через 5—10 минут остужают и фильтруют.

Ход реакции: Срезы окрашивают 5 минут (до диффузной фиолетовой окраски тканей), споласкивают дистиллированной водой и кладут в 6-процентную фосфорновольфрамовую кислоту на 30 минут, где срезы краснеют. Затем тщательно промывают дистиллированной водой, переносят на 1 минуту в 96-процентный спирт, абсолютный спирт 3—5 минут, ксилол, бальзам. Ядра — ярко-красные, плазма — синевато-красная, мускулатура — красная, соединительная ткань — бесцветная. Если срезы дифференцировать 2—5-процентной фосфорномолибденовой кислотой, то (после формалина и смеси Ценкера) ядра принимают синий цвет, мускулатура — темно-синий, эритроциты— черно-синий цвет. Соединительную ткань можно докрасить в зеленый цвет 0,05-процентным раствором ализарин-виридина (2—5 минут). Можно, также докрашивать смесью анилинового синего и оранжа G (по Маллори). Кислый а л и з а р и н о в ы й синий является, по ведущего гистохимика Роскина Г.И.  мнению, лучшим красителем для гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры; одновременно хорошо окрашиваются ядра. С нашей точки зрения это надо делать на оборот. Поскольку алюминий может протравить места селективного окрашивания ализарином ионов железа и кальция.

Г) Способ окрашивания криостатных срезов нефиксированных легких спиртовым раствором ализаринового красного С. .

Криостатные срезы легких прикрепляются на предметные стекла, покрытые желатином. Срезы легких на предметных и покровных стеклах помещают в стеклянный стаканчик, заполненный 5% спиртовом растворе ализаринового красного С. Окраска и фиксация мазков крови проводится  при комнатной температуре на протяжении 5 минут (время подбирается эмпирически).

После окрашивания мазки крови быстро ополаскиваются ацетоном, затем  их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, затем микроскопировать.

^ Суправитальный (влажный ) способ окрашивания легких спиртовым раствором ализаринового красного С (ЦНИЛ АГМА).

При суправитальном (влажном) методе окрашивания тонких кусочков легких  ализариновым красным С, гистохимическая реакция проводилась в 5% спиртовом растворе ализаринового красного С. Окраска проводится  при комнатной температуре на протяжении 24 часов (время эмпирика). Промывают кусочки легких в течение двух трех часов в ацетоне. Затем изготавливаются на замораживающем микротоме криостатные срезы. Учитывая рекомендации Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. мы разработали два похода изучению локализации продуктов окрашивания ализариновым красным срезов легких экспериментальных животных.

После получения срезов на замораживающем микротоме, срезы приклеиваются на желатинизированные предметные стекла, затем  их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, затем микроскопировать.

В случае необходимости уточнения локализации продуктов реакции, срезы можно слегка окрашивать гематоксилин-хромовые квасцы.

После получения срезов на замораживающем микротоме, срезы приклеиваются на желатинизированные предметные стекла, быстро ополаскиваются в 5% р-ре бихромат калия, затем  их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, После чего краситель становится ярко красным, затем микроскопировать.

^ Суправитальный (влажный ) способ окрашивания мазков периферической крови легких спиртовым раствором ализаринового красного С (ЦНИЛ АГМА).

При суправитальном (влажном) методе окрашивания мазков периферической крови ализариновым красным С проводилась в 5% спиртовом растворе ализаринового красного С. Мазки крови на предметных и покровных стеклах помещают в стеклянный стаканчик, заполненный 5% спиртовым растворе ализаринового красного С. Окраска и фиксация мазков крови проводится  при комнатной температуре на протяжении 5 минут (время определяется эмпирически). Учитывая рекомендации Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. (1957), мы разработали два похода изучению локализации продуктов окрашивания ализариновым красным мазков крови экспериментальных животных.

А) После окрашивания мазки крови быстро ополаскиваются ацетоном, затем  их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, затем микроскопировать.

В случае необходимости уточнения локализации продуктов реакции, мазки крови можно слегка окрашивать гематоксилин-хромовые квасцы.

Б) После окрашивания мазки крови быстро (5-10 секунд) ополаскиваются быстро ополаскиваются в 5% р-ре бихромат калия, потом быстро, но тщательно промываются в дистиллированной воде (от 5 до 30 секунд), затем мазки крови сушатся на воздухе, после высушивания   их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, (после чего краситель становится ярко красным) затем микроскопировать.

^ Метод витального окрашивания ализариновым красным С клеток, содержащихся в оральном секрете-в пробирке(ЦНИЛ АГМА).

Реактивы: 0,2% водный раствор ализариновый красным С, он изготавливается путем десятикратного разбавления 2% спиртового раствора ализаринового красного С.

Ход окрашивания: Гипотонический оральный секрет собирается в центрифужную пробирку, затем центрифугируются при 1000 оборотах в течение 10 минут. Полученный осадок. клеток отделяется от жидкой части слюны, потом на него наносится 5 мл дестилированной воды, с целью его отмывания от жидкой фазы секрета, затем снова центрифугируется с целью формирования клеточного осадка, после центрифугирования супернатант отсасывается микропипеткой. Затем на клетки, содержащиеся в пробирке наносится 5 мл 0,2% водного раствора ализаринового красного С. Процесс окрашивания происходит в течение 20—30 минут. Затем, после этого взвесь клеток орального секрета в пробирке, снова центрифугируются, клеточный осадок отмывается 10 мл дистиллированной водой от красителя. После повторного центрифугирования, клеточный осадок ресуспендируется в 3 мл дистиллированной воды, после чего из взвеси окрашенных клеток изготавливается мазок. После высыхания мазка, его обрабатывают в парах формалина. После чего краситель становится ярко красным.

^ Метод окраски мазков клеток периферической крови содержащих биофлавоноиды по Стиасни с ванилином (ЦНИЛ АГМА).

Реактивы: 6% раствор ванилина в 0,25 н соляной кислоте. Ванилин растворяют в водяной бане.

Ход методики: Мазки периферической крови фиксируются в парах формалина. Потому что при температуре 50 С. Окрашиваются 6% раствор ванилина в 0,25 н. соляной кислоте. Быстро ополаскиваются в дистиллированной воде, мазки осторожно (по краям предметного стекла) сушатся фильтровальной бумагой, после высыхания сразу микроскопируют, поскольку реакция не стойкая.

Способы химического анализа содержания в растительном сырье конденсированных дубильных вещества: производные флаванолов- 3; производные флавандиолов, производные оксистильбенов.

Предполагаемый механизм окрашивания дубильных веществ и биофлавоноидов в растительных клетках.

Известно более 6500 флавоноидов. Общепринятая классификация флавоноидов предусматривает их деление на 10 основных классов, исходя из степени окисленности трех-углеродного фрагмента. В тоже время особенности метаболизма этих веществ в организме теплокровных не достаточно изучены. Ввиду этого мы обратили внимание на то, что для ряда этих веществ, разработаны химические цветовые реакции: (Коренская И.М., Ивановская Н.П., Измалкова И.Е., 2007,Лазурьевский В. Г.. 1966., Харборн Дж, 1968, Чекалин М. А., Пасеет Б. В., Иоффе Б. А., 1972). В классических руководствах для обнаружения полифенолов, флавоноидов, катехинов в растительном сырье содержащих дубильные вещества используют следующие реакции:

Реакции, позволяющие определить группу дубильных веществ.

1.Реакция Стиасни – с 40 % раствором формальдегида и концентрированной HCl -

Конденсированные дубильные вещества образуют осадок кирпично-красного цвета

2.Бромная вода (5 г брома в 1 л воды) - к 2-3 мл испытуемого раствора прибавляют по каплям бромную воду до появления в растворе запаха брома; в случае присутствия конденсированных дубильных веществ образуется оранжевый или желтый осадок.

3. Окрашивание с солями трехвалентного железа, железоаммонийными квасцами –

черно-синее (дубильные вещества гидролизуемой группы, которые являются производными пирогаллола) или черно-зеленое (дубильные вещества конденсированной группы, которые являются производными пирокатехина).

4.Катехины дают красное окрашивание с ванилином (в присутствии концентрированной HCl или 70 %-ной H2SO4 развивается яркая красная окраска).

С 10 %-ным раствором среднего ацетата свинца (одновременно добавляют 10 %-ный раствор уксусной кислоты) образуется белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества гидролизуемой группы (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание конденсированных дубильных веществ), с 1 %-ным раствором железоаммонийных квасцов – черно-зеленое окрашивание); белый осадок, растворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества конденсированной группы.

11. При взаимодействии с 5% бихроматом калия образуется желто-коричневый осадок.

12. Для идентификации отдельных соединений используют хроматографический анализ, рассматривая в УФ-свете. Обработку хроматограмм производят раствором железа хлорида или ванилиновым реактивом

Реакция с 1 %-ным спиртовым раствором железоаммониевых квасцов или ванилином является фармакопейной, проводится с отваром из растительного сырья.
1   2   3   4   5   6

Похожие:

Целуйко С. С., Зиновьев С. В icon Аффективные нарушения при расстройствах шизофренного круга и возможности поддерживающей терапии
Зиновьев Сергей Владимирович, заместитель главного врача гуз пнд №3 г. Санкт-Петербурга, кандидат медицинских наук
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
edushk.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов