Целуйко С. С., Зиновьев С. В




Скачать 0.9 Mb.
Название Целуйко С. С., Зиновьев С. В
страница 3/6
Дата публикации 09.06.2015
Размер 0.9 Mb.
Тип Документы
edushk.ru > Биология > Документы
1   2   3   4   5   6

Метод окраски мазков гипотонического смыва назального и орального секретов фиксированных в парах формалина, окрашенных по Романовскому – Гимза в целях оценки симптома арборизаци.

У здоровых лиц сразу после воздействия низкой температуры окружающей среды на организм из нижнего носового хода с помощью ватной палочки извлекали носовой секрет. В целях потенцирования носового секрета ватную палочку смачивали дистиллированной водой. Затем ватной палочкой назальный секрет наносили на предметное стекло, на подложку из алюминиевой фольги. Предметные стекла, и алюминиевая фольга предварительно прогреваются в термостате при температуре 370С. Мазки, так же высушиваются в термостате при температуре 370С. После высыхания жидкости, сухой остаток изучался под световым микроскопом и с помощью сканирующего электронного микроскопа S-3400 Hitachi (Япония). Мазки клеток назального секрета фиксировали в парах формалина, окрашивали по Романовскому-Гимза.

Дополнительно изучается секрет ротовой полости: утром натощак пациент поласкает рот 100 мл дистиллированной воды в течение 2 минут для освобождения полости рта от остатков пищи. Через 15 минут проводили, повторное тщательное полоскание полости рта дистиллированной водой (10 мл). Из промывной жидкости делают мазки на предметном стекле и на подложке из алюминиевой фольги. Морфометрический анализ кристаллографической картины проводился на микрофотографиях. Степень выраженности симптома папоротника определяется балами: 0 балов (-) - кристаллизация отсутствует, слизь аморфная; 1 бал (+) - кристаллизация со смазанным нечетким рисунком в виде отдельных стеблей и игл кристаллов; 2 бала (++) - четко выраженная структура листа папоротника с тонким и ясным рисунком; 3 бала (+++) - крупные кристаллы, массивные стебли, ветви расходятся под уг­лом 90°.

^ Гистохимические подходы выявления антимонатом ионов натрия, кальция, железа, цинка в назальном и оральном секретах человека.

Светооптический способ модификация метода окраски пироантимонатом калия назального и орального секретов по Сина, Мидузухира, Амакава, и Футэсаку.

Реактивы: 1 мл 4% водного раствора тетраоскида осмия и 3 мл 2% пирогексаантимонгата калия (растворяют при кипячении, затем охлаждают) и в случае необходимости доводят раствор до рН 7,4 0,01 н уксусной кислотой.

Ход окраски: Мазки назального и орального секрета после высыхания фиксируются в парах формалина. Затем при комнатной температуре мазки окрашиваются антимонатом калия и осмия в течение 1-2 часов. После окрашивания мазки промываются дистиллированной водой. Учитывая, что осмиевая кислота (тетраоксид осмия является ядом, мы рекомендуем накрывать мазки биологических жидкостей покровным стеклом).

^ Метод витальной окраски клеток орального секрета дитизоном в пробирке

Реактивы: 0,2% водный раствор дитизона, он изготавливается путем десятикратного разбавления 1 % спиртового раствора дитизона. Для приготовления основного 1%-го водно-аммиачного раствора дитизона для инъекций в колбу с притертой пробкой наливали 45 мл 50% этанола, добавляли 0,9 мл 25%-го раствора гидроокиси  аммония и 600 мг дитизона. Смесь перемешивали на водяной бане (70 °С) в течение 10 мин, затем фильтровали через беззольный фильтр. Рабочий 0,2%-й раствор дитизона для цитохимических исследований готовили пятикратным разбавлением дистиллированной водой основного раствора. Поскольку дитизон растворим в воде при щелочных значениях среды, для его растворения воду подщелачивали раствором гидроокиси аммония. Известно, что водно-аммиачный раствор, на основе которого изготавливался раствор дитизона не вызывает изменений в клетках (Ещенко Ю.В., 2011).

Ход окрашивания: Гипотонический оральный секрет собирается в центрифужную пробирку, затем центрифугируются при 1000 оборотах в течение 10 минут. Полученный осадок клеток отделяется от жидкой части слюны, потом на него наносится 5 мл дистиллированной воды, с целью его отмывания от жидкой фазы секрета, затем снова центрифугируется с целью формирования клеточного осадка, после центрифугирования супернатант отсасывается микропипеткой. Затем на клетки, содержащиеся в пробирке наносится 5 мл 0,2% водного раствора дитизона. Процесс окрашивания происходит в течение 20—30 минут. Затем, после этого взвесь клеток орального секрета в пробирке, снова центрифугируются, клеточный осадок отмывается 10 мл дистиллированной водой аммиака от красителя. После повторного центрифугирования, клеточный осадок ресуспендируется в 3 мл дистиллированной воды аммиака, затем из взвеси окрашенных клеток изготавливается мазок. После высыхания мазка, его отмывают в ацетоне. После чего мазко быстро окрашивают (5-10 секунд) в р-р азур 2 по Нохту.

  1. Предполагаемые механизмы методов гистохимического исследования неорганического кальция, железа и витаминов в кровеносных сосудах респираторного отдела легких и в клетках периферической крови при коррекции экспериментального стресса дигдрокверцетином.

С точки зрения ведущих специалистов в области морфологии адаптационных процессов и патологии современные представление о структурном гомеостазе, как показателе целости тканей, органов, функциональных систем организма исходят из гистофизиологического определения адаптации, регенерации, пат. анатомического определения дистрофии, атрофии, некроза, склероза, и др., а так же хирургического определения травмы, раны, ссадины, кровоподтека, кровоизлияния, язвы и др.. В случае стресса, так же развивается изъязвление слизистых оболочек. ( А. И. Струкова, В. В. Серова, Д. С. Саркисова, 1990; Под ред. Т. Е. Ивановской, Б. С. Гусман, 1981; Саркисов Д. С., 1977; Саркисов Д. С., 1970; Саркисов Д. С., Аруин Л. И., Туманов В. П.., 1983; Саркисов Д. С., Пальцев М. А., Хитров Н. К.., 1997; Струков А. И., Серов В. В., 1995; Г. И. Лазюка., 1991. По данным Струкова А.И. 1995, при дистрофических состояниях в результате повреждения тканей происходит спазм, тромбоз кровеносных сосудов, агрегация и выход эритроцитов за пределы кровеносного русла. После гемолиза эритроцитов, в тканях накапливается гемоглобин, который в течение 5-6 дней превращается в метгемоглобин, вердхромоген, а затем биливердин и билирубин. Продукты распада эритроцитов, а именно неорганическое железо формируют катаболический ферритин, который является, составной частью пигмента гемосидерина, другая часть неорганического железа, возвращаясь в красный костный мозг, превращается в анаболический ферритин, который участвует в синтезе гемма. SS-ферритин (окисленный ферритин) — ферритин, присутствующий в организме в нормальных условиях (при достаточном обеспечении тканей кислородом). SH-ферритин (восстановленный ферритин) образуется при тяжёлой гипоксии. Он обладает выраженным сосудорасширяющим действием (антагонист адреналина) и способствует развитию артериальной гипотензии (Авцын А. П., Шахламов В. А.., 1979;Давыдовский И. В., 1969; Калитеевский П. Ф. 1987; Д. С. Саркисова и Ю. Л. Перова.— М., 1996;. А. И. Струкова, В. В. Серова, Д. С. Саркисова, 1990; Т. Е. Ивановской, Б. С. Гусман, 1981; Серов В. В., Пауков В. С., 1975.ru/; Струков А. И., Серов В.В., 1995). Ввиду этого, в настоящее время большое клинико-морфологическое значение приобрели методы гистохимического окрашивания основанные на выявлении ионов неорганического железа, и др. микроэлементов в составе пигмента гемосидерина, в эритроцитах, эритроидных клетках, макрофагах. Учитывая важное значение общего и местного гемосидероза, наряду с реакций берлинской лазури и реакцией Тирмана, Саркисов Д.С и др., 1996 выделяет реакцию турнублевой сини в отдельную гистохимическую реакцию выявляющею ионы двухвалентного железа. Гистохимическое выявление  двух валентного и трехвалентного железа в легких экспериментальных животных проводится с помощью жёлтой кровяной соли (Гексацианоферрат(II) калия (железистосинеродистый калий, ферроцианид калия, гексацианоферрат калия) комплексное соединение двухвалентного железа K4[Fe(CN)6], существующее обычно в виде тригидрата K4[Fe(CN)6]·3H2O) и красной кровяной соли   (Железосинеродистый калий— Гексацианоферрат (III) калия). Гексацианоферрат (III) калия (железосинеродистый калий, феррицианид калия, гексацианоферрат калия) комплексное соединение трёхвалентного железа K3[Fe(CN)6] это сильный яд. Принцип гистохимического выявления гемосидерина основан на образовании продукта окрашивания железа в ходе реакции турнбулевой сини и берлинской лазури представленном зернышками синего цвета в клетках, кровеносных микрососудах и межклеточном веществе. В процессе фиксации, обезвоживания, заливки органов и клеток при изготовлении цитологических и гистологических препаратов часть веществ теряется в результате растворения в реактивах  или в результате окисления. Кроме того, срезы во время окрашивания могут отсоединиться от предметных стекол.  По этому с нашей точки зрения окрашивание органов можно производить влажным методом в пробирке. Мы считаем, что такой подход исследования влажных препаратов легких относиться к суправитальным методам окрашивания. Легкие фиксируются в формалине, по этому необходимо уделить внимание промыванию кусочков, после фиксации  кусочки легких отмываются от формалина в спиртах и дистиллированной воде.  Необходимость отмывки в спиртах так же заключается в дополнительной постфиксации легких, из которых в последующем будут изготавливаться криостатные срезы. С нашей точки зрения этап промывки в спиртах лучше избегать, так как удлиняется процесс замораживания кусочков в криостате. В процесс фиксации легких в формалине образуется дополнительные гемминовые пигменты, которые препятствуют обнаружению соединений железа, в то же время эти пигменты обладают псевдопероксидазной  активностью.   По нашим данным реакция турнбулевой синь дает более надежные результаты, чем берлинская лазурь, поскольку последняя в случае патогенного влияния внешней среды на организм позволяет выявлять очень грубые осадки, которые препятствуют микроскопии. Реакция Турнбулевой сини является более чувствительной. При этом по данным Луппа Х., 1980; Саркисова Д.С., 1996, реакцию образования Турунбулевой сини следует отличать от реакции Тирмана, которую используют, для изучения общих запасов железа используется. Реакция Тирмана выявляет все железосодержащие пигменты. Тканевый срез при этом сначала обрабатывается восстановителем (например, сульфидом аммония), после чего окрашивается красной кровяной солью. Трёхвалентное железо гематинов под влиянием восстановителя превращается в двухвалентное, а красная кровяная соль окрашивает все железосодержащие соединений в синий цвет (образовавшееся вещество синего цвета называется турнбуллева синь). Обычно реакцию Тирмана использует вместе реакцией Перлса для диагностики гемосидероза, выявления запасов железа в случае его дефицита. Перед, изготовлением срезов, кусочки органов необходимо тщательно промыть. Потом заморозить в морозильнике микротома. В силу чувствительности реакции кусочки органов необходимо приклеивать к препаровальному блоку в замороженном виде. Поскольку после изготовления срезов на замораживающем микротоме, срезы помещают вводу для расправления и приклеивания к предметному стеклу,  замороженные срезы необходимо снимать с бритвы микротоме  стеклянной иглой, а наносить на предметное стекло пластиковой кисточкой. Для приклеивания срезов используется желатин. Заморозка органов дает наилучшие результаты, для гистохимических исследований неорганических веществ, так как появляется возможность окраски тонких кусочков органов, что исключает появление неспецифических осадков красителя. В отличие от гистологических руководств, в гематологических руководствах для выявления ионов неорганического железа с помощью реакции Тирмана, Перлса, Турнубулевой сини рекомендуют использовать температуру 50-600 С, для выполнения этих классические метод исследования ионов железа методом Douglas A.S., Dacie J.V. (М.Я. Суботин, С.С. Лагучев, Т.Г. Оганесян и др., 1954, Лупа 1980,Кост Е.А., Москва 1975; И. Бернат, 1975; Douglas A.S., Dacie J.V., 1953; Caudill J.S., Imran H, et all.,2008; Camaschella C, 2008; Saini, N, Jacobson, JO, et all.2012; Warren D., BowanJ.R.,1961). Так же, обе реакции активно используют для гистохимического  выявления липофусцина, билирубина, меди.

По мнению большинства, с помощью, метода фон Косса выявляется фосфат кальция.

а) Метод фон Косса направлен на выявления фосфата кальция в гистологических препаратах путем их импрегнации раствором нитрата серебра с последующей фиксацией гипосульфитом натрия; участки, содержащие фосфат кальция, окрашиваются в черный цвет;
Метод фон Косса является классическим гистохимическим способом окрашивания биологических структур содержащих соли фосфата кальция (Пирс Э. 1962,C. F. A. Culling 1974). Метод фон Косса, в классическом виде предназначен для окрашивания биоструктур содержащих фосфат кальция, а именно костной ткани. По данным Лили (1969) в этом методе используется водный раствор нитрата серебра для окрашивания костной ткани. Этот метод основан на мнении, что при взаимодействии нитрата серебра с фосфатом кальция происходит образование металлического серебра. При этом продукт реакции закрепляется после промывания гипосульфитом. В то же время другие авторы указывает на неспецифический характер этой гистохимической реакции. По данным Гайер и др. (1974) раствор нитрата серебра способен неспецифически окрашивать ядро, ядрышко, митохондрии клеток, выявлять ретикулярные волокна соединительной ткани, хлориды и т.д. При этом известно, что формалин и цинк участвуют в металлизации азотнокислого серебра. В реакции 2 AgNO3 + Zn = 2Ag + Zn(NO3)2 (Пятницкий В.М., Сухан Д.В., 1975; Румянцев Д.В., 1987, Реми Г.,1966). В случае введения селенида натрия или селенит натрия в организм экспериментальных животных, приводит к появлению цинк-селен нанокристаллов в местах, где обнаруживаются слабо связанные ионы цинка. Эти нанокристаллы в свою очередь могут быть выявлены с помощью метода аутометаллографии, при котором используется серебрение нанокристаллов. Метод селенида натрия был введен, как инструмент для выявления цинка в синаптических пузырьках (ZEN) терминалов в центральной нервной системе, а также для визуализации ионов цинка в ZEN секреторные пузырьки, например, соматотропных клеток в гипофизе, зимогенных гранул в панкреатических ацинарных клеток, бета-клетки островков Лангерганса, клетки Панета, и др. (Danscher G, Stoltenberg M., 2005). Способность нитрата серебра окрашивать ядрышковые структуры легла в основу метода выявления ядрышкового организатора, который предложила генетик Мак-Клиннток (Ченцов Ю.С.,2004).

Интерес к этому методу окрашивания тканей и клеток, так же обусловлен, тем, что окрашивание аскорбиновой кислоты раствором нитрата серебра лежит в основе метода Жиру-Леблона. Глюкоза и другие альдегиды (реакция серебряного зеркала) при взаимодействии с аммиачным раствором нитрата серебра способны восстанавливать катион серебра до металлического серебра. По данным гистохимических и фармакопейных исследований в уксуснокислом спиртовом растворе нитрата серебра происходит реакция (Жиру-Леблона) взаимодействия аскорбиновой кислоты с раствором нитрата серебра, в котором его катион восстанавливается до металлического серебра аскорбиновая превращается кислота в  дегидроаскорбиновую кислоту. По видимому в генезе реакции следует учитывать, что 20% уксусная кислота должна хорошо растворять кристаллы фосфата кальция, при этом способствуя его извлечению из клеток. По этому аскорбиновая кислота, в такой реакции должна активно взаимодействовать с нитратом серебра (Chinoy N. J. 1969., Chinoy N. J. and Sanjeevan A. G., 1978, Chinoy N. J.1969, Nandita Shah, 1975, Dhar, A. C. Patel K. R. and Shah C. K.1980; Prasad T. K., Dave Y. S. and Mehta P. M., 1981;Ravi R. Hegde,1985; Törk I.,1970; Bauer, M. Balogh D. and Kompatscher P., 1984; Claragh Healy, Mark Canney, et all., 2007).

Ализарины, пурпурины и др. антрахиноны это протравные красители и фармакологические вещества (Brinkworth R.I., Fairlie D.P., 1995; de Ferreyra E.C., Villarruel M.C., Bernacchi A.S., et al. 1992; Lorenz D., Lucker P.W., Krumbiege G., et al. 1985). По мнению большинства исследователей, помощью гистохимической реакции окрашивания ализариновым красным С выявляется кальций и железо (Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б., 1957; Лили Р., 1969; Луппа Х., 1980,   Саркисов Д. С. и Перов Ю.Л., 1996. Гайер Г., 1974, Лилли Р., 1980; de Ferreyra E.C., Villarruel M.C., Bernacchi A.S., et al.. 1992;Derksen G.C., Lelyveld G.P., van Beek T.A., et al.. 2004; Elbadawi A., Musto L.A., Lilien O.M., 1981; Myers H.M. 1968; Norton SA. 1998; Paul H., Reginato A.J., Schumacher, HR.. 1983; Poginsky B, Westendorf J, Blomeke B, et al. 1991; Rubin PL, Bisk F. 1969; Meloan S.N. et all. 1972; Puchtler H., Meloan S.N., Terry M.S., 1969; Puchtler H., Meloan S.N., et all. (1969). Ализарины, пурпурины и др. антрахиноны являются производными антраценов, которые получают из растительного сырья или путем органического синтеза (Селиванов Е.В., 2003. Hans-Samuel Bien, J. Stawitz, K. Wunderlich 2005 Wiley-V.C.H., Weinheim: 2005, Padma S. Vankar, Rakhi Shanker, Debajit Mahanta and S.C. Tiwari (2008).) В 1868 г. немецкие химики Гребе и Либерман показали, что как ализарин, так и пурпурин представляют производные углеводорода антрацена: первый — диоксиантрахинон C14H6O2(HO)2, второй — триоксиантрахинон C14H5O2(HO)3. Эти работы послужили основанием обширной отрасли химической промышленности, производству искусственного ализарина. Исследования антраценов, и антрахинонов, ализаринов, пурпуринов в растительном сырье (марена, крушина, сена и др.) основано на реакции Борнтрейгера (Коренская И.М., Ивановская Н.П., Измалкова И.Е., 2007). Сущность метода заключается в том, что в водных щелочных отварах растительного сырья содержащего антрацены происходит превращение антрогликозидов в антрахиноны, которые содержат фенольную группировку, феноляты приобретают в щелочной среде способность к растворению в воде. В случае подкисления раствора феноляты становятся жирорастворимыми, по этому хорошо растворяются в хлороформе, при этом антрахиноны дают желтое окрашивание. При встряхивании р-ра хлороформа содержащего антрахиноны с добавлением 10% аммиака происходит вишнево-красное окрашивание антрахинонов. При этом образуется слой 1,8 диоксиантрахинонов окрашенный вишнево-красный цвет, слой 1,4 диоксиантрахинонов окрашенных в пурпурный цвет, 1,2 диоксиантрахинонов окрашенных в фиолетовый цвет. (Белодубровская Г.А., Березина В.С., Блинова К.Ф. и др., 2006).

По данным современных справочников по неорганической химии АЛИЗАРИНОВЫЙ КРАСНЫЙ С (ализарин С; Na-соль 9,10-дигидро-3,4-дигидрокси-9,10-диоксо-2-антраценсульфокислоты), молекулярная масса 360,28; это оранжево-желтое в-во; температура плавления 300оС; раств. в воде, этаноле, не раств. в бензоле, бензине, хлороформе. В водных р-рах рКа для ализарина красного и его однозарядного аниона соотв. 5,5 и 9,5; λmax 423 нм. Получают сульфированием ализарина. Ализарин красный С - реагент для фотометрич. определения Al, Sc, Y и F( Каррер П., 1960).

При гистохимическом исследовании механизма минерализации костной ткани, который изучался с помощью прижизненного введения ализарина красного С в организм был сделан вывод о том, что этот реагент способен специфически окрашивать соединения кальция в организме (Kasper G., Mao L., Geissler S., Trippens J., Kuehnisch J., Perka C.,. Duda G. N, 2008).

Поскольку этот способ окрашивания подтверждается при выявлении кальция фосфата раствором нитрата серебра по методу фон Косса, способ окрашивания ализариновым красным С тканей был введен в классические и современные руководства по микроскопической технике (Лили Р., 1969,1980). Многие красители, например гематоксилин, не способны давать окрашивание клеток без протрав, с которыми они образуют солеобразные соединения – лаки. В качестве протрав используют соли алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия, эти вещества изменяют заряд раствора красителя, при этом краситель приобретает новые свойства (Горбунова Т. К.2008). В случае ализаринового красного С протравами является соли металлов: хрома, алюминия, кальция, железа, меди (K.-K. Shiu, Oi-Yin Chan, 1995; Wang Z., Liu X., Baeyens W.R., Delanghe J.R., Ouyang J., 2008; Fang-Ying Wu, Wen-sheng Liao, Yu-Mei Wu, Xiao-Fen Wan., 2008; Sangal S.P. 1965; Yadav L., Sanjay S.S., Ankit P., 2010; Ghasemi J., Lotfi S., Safaeian M., et all., 2006; Adams M.L., O'Sullivan B., Downard A.J., Powell K.J. 2002;Wu L., Forsling W., 1992;. Иванов В.М., Адамова В.М., Фигуровская В.Н. 2010;Файн В.Я., 2004; Подчайнова В.Н., Симонова Л.Н.., 1990.; Кропачева Т.Н., Леконцева А.А., Корнев В.И., 2011). При этом по данным химических исследований предполагается, то, что взаимодействие ализаринового красного с кальцием, алюминием, медью определяется рН раствора в реакционной среде. При этом большинство авторов, учитывая реакцию Борнтрейгера, с целью создания щелочной среды, добавляют аммиак в раствор ализаринового красного С, с целью формирования вишнево-красного или малинового окрашивания лаков ализарина с металлами. АЛИЗАРИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ, известны в качестве протрав­ных красителей. Все они закрепляются на волокнах посредством протрав, представляющих различные ме­таллические соли, и дают с ними лаки разнообразных цветов: Некоторые из них яв­ляются хромировочными, т.-е. способными после крашения закрепляться на волокне раствором бихромата калия (Каррер П. , 1960). По этому, крупнейший специалист в области гистохимии Роскин предлагает использовать в качестве протравы алюмокалиевые квасцы для окрашивания ализарином эритроцитов и мышечной ткани (Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б.,1957).

Мы провели гистохимическое исследование локализации ионов неорганического железа, кальция в органах дыхания и в клетках периферической крови крыс подвергнутых воздействию общего в течение трех месяцев. В целях коррекции окислительного стресса части животным вводили перорально дигидрокверцетин. Условия эксперимента, в котором мы вводили перорально дигидрокверцетин были, нами опубликованы ранее (Зиновьев С.В., 2012). С учетом рекомендаций по испытанию фармакологической активности дигидрокверцетина группы (Круглова О.Г., 2012), мы выбрали в качестве контрольной группы белых крыс, которых в экспериментальных условиях подвергали воздействию низкой температуры окружающей среды в климатокамере на протяжении трех месяцев. Результаты нашего гистохимического исследования локализации двухвалентного железа в периферических отделах легких, подтверждают данные других авторов, которые обнаружили: гиперемию легких, диапедез эритроцитов за пределы капилляров в соединительную ткань бронхиального дерева и склероз сосудов легких в случае адаптации человека к климату Крайнего Севера (Луценко М.Т., 1994). При влажном окрашивании гексацианфератом фиксированных в формалине легких крыс целью выявления трехвалентного железа мы обнаружили выраженное отложение продукта реакции - берлинской лазури в стенке кровеносных сосудов венозного русла. При этом интенсивно прокрашиваются мелкие вены и венулы легких, в которых обнаруживаются явления полнокровия. Однако ввиду интенсивного окрашивания берлинской лазури сложно оценить выраженность этой реакции в различных экспериментальных группах. При реакции турнбулевой сини наоборот, нами отмечено умеренное окрашивание легочных структур, которое отражает динамику воздействия низких температур на организм экспериментальных животных. В настоящем исследовании в случае интактных животных мы обнаруживаем в ткани легких только мелкие гранулы (0,2 мкм) турнбулевой сини в тканях легких. При гистохимическом выявлении неорганического двухвалентного железа мы отмечаем интенсивное отложение гранул (более 0,5 мкм) турнбулевой сини в криостатных срезах тканей периферических отделов легких контрольной группы крыс, подвергнутой воздействию низкой температуры окружающей среды. По-видимому, отложение турнбулевой сини являются проявлением местного гемосидероза легких крыс. С нашей точки зрения, источником неорганического железа в ткани легкого является активный внутрисосудистый гемолиз и диапедез эритроцитов в капиллярах. При этом отмечаются явления гипертрофии эндотелиальных клеток, которые представлены округлыми комплексами мономорфных клеточных элементов расположенных рядом с капиллярами и стенкой альвеол. В венулах и артериолах легких происходит обильное кровенаполнение коллатералей, при этом нарушается форма сосудов (спирализация, вздутия, карманы), имеются признаки гипертрофии клеток внутренней оболочки. Рядом с сосудистой стенкой, или в просвете сосудов микроциркуляторного русла наблюдаются единичные митозы клеток. Складывается впечатление, что происходит эктопия эндотелия, при которой эти клетки проникают на внешнюю оболочку артерий. В нижних дыхательных путях скапливается бронхиальный секрет, который содержит эритроциты, и другие клетки, отмечается его кристаллизация. В случае третьей и четвертой групп экспериментальных животных реакция турнбулевой сини в легких представлена мелкими гранулами (0,2 мкм) расположенными преимущественно в корне легких, а именно в бронхиальном секрете, в стенке бронхов, вен и периферических ветвей легочной артерии. Это можно объяснить тем, что снижается гиперемия сосудов микроциркуляторного русла легких. Учитывая очень маленький размер обнаруженных гранул, мы провели дополнительное гистохимическое исследование легких крыс. По данным Струкова А.И. (1990) гистохимическая реакция Коса на кальций дает положительный результат в случае тромбоза сосудов человека. Обнаружено отложение ионов кальция в клетках органов дыхания и сосудах легких, периферической крови в случае бронхиальной астмы (Кириченко В.И., Дорофиенко Н.Н. 2000). По нашим данным ализарин красный способен к селективному суправитальному окрашиванию тромбов и стенки сосудов (Зиновьев С.В. 2012). В случае экспериментального воздействия холода на организм экспериментальных животных мы отмечаем тромбоз мелких вен и артериол. В просвете венозного русла отмечаются ярко окрашенные ализарином крупные агрегаты эритроцитов и тромбы. При окрашивании по методу фон Косса криостатных срезов легких, отмечается неспецифическое выпадения осадка нитрата серебра по всей площади среза, что препятствует микроскопическому исследованию органов дыхания. В такой ситуации отмечается слабое окрашивание части клеточных элементов входящих в состав стенки альвеол ацинуса легких. Учитывая аргентофилию ядрышкового организатора, гистохимический механизм метода фон Косса остается непонятным. По нашим данным в случае фиксации в этаноле мазков бронхоальвеолярного лаважа пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, с помощью раствора нитрата серебра успешно выявляется ядрышковый организатор. При этом отмечается неспецифическое диффузное окрашивание нитратом серебра голых ядер эпителиальных клеток, цитоплазмы цилиндрических эпителиальных клеток. В части клеточных элементов обнаруживается гранулярное окрашивание цитоплазмы. В тоже время при этом отмечается, что нестойкий характер окрашивания ядрышкового организатора в случае промывания мазков в гипосульфите. Ввиду того, что метод фон Коса остается не достаточно изученным, а так же учитывая, что биофлавоноиды и дигидрокверцетин участвуют в регуляции обмена аскорбиновой кислоты, мы решили использовать метод окрашивания раствором нитратом серебра в спирт-ацетата по Чойни (реакция Жиру Леблона). Нами обнаружено, что при коррекции дигидрокверцетином холодового стресса у крыс отмечается умеренное окрашивание ядра, и цитоплазмы незначительной части альвеолоцитов и др. клеточных элементов. При суправитальном выявлении аскорбиновой кислоты в криостатных срезах легких крыс, мы обнаружили несколько типов аргентофинных гранул, которые характеризуют присутствие аскорбиновой кислоты в тканях и клетках. При исследовании органов дыхания крыс нами обнаружено сродство к азотнокислому серебру клеток стенки вен, клеточных элементов ацинусов легких. Мелкие гранулы около 0,2 мкм, обнаруживаются в толстых участках срезов в составе клеток альвеол, стенок сосудов, а так же межклеточного вещества соединительной ткани легких межацинарного пространства. Крупные гранулы имеют размер более 0,5 мкм. В ряде случаев в четвертой группе экспериментальных животных мы обнаружили отложение крупных гранул аргентофинного материала в составе стенки вен легких. Крупные гранулы аргентофильного материла, характеризуют отложение аскорбиновой кислоты в клетках, локализованных в внутренней оболочки, в наружной оболочке вен органов дыхания, а так же в ткани ацинуса легких расположенных рядом венами. В обнаруженных нами аргентофильных клетках, цитоплазма полностью заполнена крупными гранулами восстановленного серебра, которые приобретают черно-коричневую окраску, при этом окрашивается ядрышковый организатор. Раствор азотнокислого серебра способен к окрашиванию ионов кальция в тканях. По этому, с целью контроля специфичности реакции с аскорбиновой кислотой, мы провели гистохимическое исследование с помощью окрашивания криостатных срезов ализариновым красным С. При всех методах окрашивании ализариновым красным С криостатных срезов легких отмечается сродство этого красителя к кровеносным сосудам легких и клеткам крови). При обычном методе окрашивания криостатных срезов спиртовым раствором ализаринового красного С специфически окрашивается стенка вен легких, так же собственная пластинка слизистой оболочки бронхиального дерева. В случае общего охлаждения организма при влажном окрашивании ализарином легких в просвете венозных сосудов обнаруживаются скопления крупных гранулы красителя. При этом стенка мелких вен, так же интенсивно окрашивается ализарином. В интактной группе животных, мы обнаруживаем, что гематоксилин, активно прокрашивает ядра клеточных элементов межальвеолярных перегородкою, в которых отсутствуют отложения ализарина. При общем охлаждении крыс, которое продолжалось в течение трех месяцев, при докрашивании этих срезов гематоксилином, обнаруживаются видоизмененные артериолы и венулы, осуществляющие кровоснабжение респираторного отдела легких. На среднем увеличении обнаруживается повышенный рисунок кровеносных сосудов, который отсутствует в норме. Во внутренней оболочке, этих кровеносных сосудов обнаруживается несколько слоев эндотелия, в результате отложения ализарина эритроциты просвете сосудов окрашиваются в красный цвет. Это говорит о взаимосвязи между гипертрофией эндотелия кровеносных сосудов и их сродством ализариновому красному С. При этом в артериолах и венулах обнаруживаются крупные оранжевые гранулы ализаринового красного С. Видоизменные артериолы легких имеют спиральную форму, что характерно для гипертензии. Раннее мы обнаружили, что при окрашивании по метод Dahl,s в модификации Мак-Ги-Рассела, ализарин демонстрирует мелкогранулярный осадок на поверхности эритроцитов периферической крови в случае экспериментального охлаждения организма кроликов. В настоящем исследовании, замороженных срезов легких нами обнаруживается мелкогранулярное окрашивание ализарином красным С клеток крови, содержащихся в венах органов дыхания, в случае третьей и четвертой групп экспериментальных животных. В случае коррекции дигидрокверцетином при влажном окрашивании ализарином легких складывается впечатление, что катионы металлов проникают в большом количестве за пределы вен, в ткань органов дыхания, где отмечается выраженный мелко гранулярный продукт окрашивания ализарином, который отлагается на поверхности волокон и клеток соединительной ткани, а так же на поверхности клеточных элементов альвеол, бронхиального секрета. При этом ранее на мазках костного мозга, периферической крови мы изучали эритрон кроликов в случае экспериментального воздействия низких температур на организм. В данном случае при растровой микроскопии мы обнаружили ультраструктурные проявления повреждения мембран эритроцитов, которые характерны для нарушения обмена железа (Зиновьев С.В. 1988). В такой ситуации в крови присутствуют микроциты и мишеневидные эритроциты. В случае общего охлаждения организма в данном эксперименте при окрашивании мазков у спирт-ацетатном растворе нитрат серебра, который докрашивали в Азур 2, нами обнаружено, что в мазках периферической крови экспериментальных животных присутствуют полихроматофильные эритроциты. Количество полихроматофильных эритроцитов составляет от 5-10 % от всех эритроцитов. Полихроматофильные эритроциты, отличие от нормоцитов интенсивно базофильно прокрашиваются в кислой среде Азуром II . В случае общего охлаждения крыс, которое продолжалось в течение трех месяцев в лимфоцитах отмечаются крупные ядрышки (диаметром 0, 5-1 мкм) окрашенные азуром, в сегментоядерных лейкоцитах, так же отмечаются точечные азурофильные уплотнения хроматина, которые мы расценили как ядрышки. В цитоплазме незначительной части лимфоцитов отмечается отложение очень мелких гранул (менее 0,2 мкм) металлического серебра. У 20 % животных подвергнутых холодовому стрессу отмечается слабогранулярное окрашивание эритроцитов алкоголь-ацетатном р-ром нитрата серебра, которое представлено отложением черных гранул металлического серебра на поверхности эритроцитов. При этом отмечается, отрицательная аргентофильная реакция в полихроматофильных эритроцитах. Результаты этого исследования подтверждает полученные нами данные о достоверном изменении формулы крови при 14 дневном охлаждении крыс (Зиновьев С.В. 1995,1996). В другом исследовании БАЛ крыс подвернутых холодовому стрессу при 10 дневном переохлаждении организма, мы так же обнаруживали, достоверное увеличение морфометрических параметров лимфоцитов, что доказывает повышение содержания больших и средних лимфоцитов в легких животных (Зиновьев С.В., Целуйко С.С. 1999, Зиновьев С.В. 2002). При коррекции дигидрокверцетином длительного холодового стресса реакция окрашивания нитратом серебра мазков периферической крови представлена отчетливым отложением гранул металлического серебра в цитоплазме лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов.

У 50% животных этой группы отмечается гранулярное окрашивание эритроцитов алкоголь-ацетатном р-ром нитрата серебра, которое представлено отложением черных гранул металлического серебра на всей поверхности эритроцитов. Ввиду наличия гранулярного окрашивания нитратом серебра клеток крови мы провели реакцию ванилин-соляная кислота на мазках периферической крови фиксированных в парах формалина. На поверхность мазков крови сразу после фиксации наносилась реакционная смесь 3% ванилина растворенного в водяной бани в 0,25 н соляной кислоте. Окрашивание продолжалось в течение одного часа при температуре 50 С. При общем охлаждении организма крыс на поверхности эритроцитов отмечается слабая пылевидная зернистость малинового цвета (0,2 мкм). При коррекции дигидрокверцетином холодового стресса отмечается более крупная красная зернистость (0,2-04 мкм), которая нередко целиком покрывает всю поверхность эритроцитов.

Зернистое окрашивание эритроцитов и лейкоцитов раствором нитрата серебра, а так же при воздействии солянокислым раствором ванилина на мазки, фиксированные в парах формалина, подтверждается при окрашивании ализариновым красным С. В случае влажного окрашивания мазков периферической крови спиртовым раствором ализаринового красного С на поверхности эритроцитов обнаруживаются мелкие гранулы. В цитоплазме сегментоядерных лейкоцитов так же обнаруживается зернистость, которая может заполнять весь объем цитоплазмы. В случае Dahl,s метода, наоборот окрашиваются ядра лейкоцитов. По этому, в случае обоих методов окрашивания ализарином, существует противоположно направленные реакции ядра и цитоплазмы. Хотя в случае влажного окрашивания, после высыхания мазки крови, мазки помещали в пары аммиака.

После промывки мазков крови в бихромате калия, интенсивность гранулярного окрашивания эритроцитов резко увеличивается, становятся репрезентативными. В данной модификации метода влажного окрашивания спиртовым раствором ализарина, мы наблюдаем, что на поверхности эритроцитов отлагается кирпично-красные гранулы. При этом часть эритроцитов покрываются гранулами полностью, другая часть эритроцитов имеет гранулы по периферии клетки. При этом у интактных животных окрашивается 90% эритроцитов, в случае общего охлаждения продолжавшегося три месяца окрашивается 80 % эритроцитов, при коррекции дигидрокверцетином холодового стресса ализарином окрашивается 90% эритроцитов.

В случае суправитального окрашивания ализарином срезов легких, в случае промывки в бихромате калия препаратов, эритроциты, которые содержатся в кровеносных сосудах избирательно окрашиваются в красный цвет. При этом в случае общего охлаждения организма гистохимическая реакция демонстрирует резкое выраженное полнокровие кровеносных сосудов легких. При изучении просвета кровеносных сосудов, мы обнаруживаем эритроциты, которые имеют характерную двояковогнутую форму. В других сосудах венозного бассейна отмечается агрегация эритроцитов, в результате чего отмечается деформация кровеносного сосуда.

При использовании в качестве протравы бихромат калия в легких обнаруживаются клетки цитоплазма и ядра, которых окрашиваются ализарином в бледно-лиловый или бледно-малиновый цвет. Стенка легочных вен, так же демонстрирует высокое сродство к ализарину. Соединительная ткань легких слабо окрашена. В составе эпителия альвеол, между волокнами соединительной ткани обнаруживаются ярко окрашенные клетки, в цитоплазме которых обнаруживаются малиновые, и красно-вишневые гранулы.

Таким образом, при общем охлаждении организма животных отмечаются явления мелкоочагового гемосидероза. Это объективно доказывает формирование очагов повреждения кровеносных сосудов респираторного отдела легких, через которые эритроциты проникают в ткани органов дыхания.

Признавая существование структурного гомеостаза, который у человека представлен анатомической целостным комплексом предадаптаций, следует вспомнить представления Заварзина А.А. (2000), о том, что эукариотическая клетка является морфобиохимической основой, для формирования надклеточной системы саморегуляции организма. Эволюция процесса синтеза белка, и эволюция геминовых белков привела к формированию эукариотической клетки. Появление системы ядрышко-рибосом и системы митохондрии-геимновые белки привело к усовершенствованию энергетического и пластического обеспечения жизнедеятельности эукариотической клетки в отличие от прокариотической клетки. В отличие, от микроструктурных, гистохимические реакции, направленные на выявление ионов неорганических веществ, ядрышка, рибосом, аскорбиновой кислоты, они имеют фундаментальное значение, поскольку точно отделяют морфологически норму от морфологическую патологию с учетом пространственной ориентацией биомолекул, придающим им адаптивные и регуляторные свойства. Реакции Перлса, Тирман и гистохимия базофильных и оксифильных красителей, хорошо изучены. в то же время в отличие от этих методов гистохимии, мало известны реакции Борнтрейгера, Жиру-Леблона, Стиасни, Турнубулевой сини. По этому мы изучили предполагаемые механизмы окрашивания этих гистохимических реакций, учитывая наличие прототипов в виде метода выявления ионов кальция ализариновым красы С по Мак-Ги- Расселу (Dhul,s), метода фон Коса, метода Тирмана, арборизации. Во всех случаях использования этих гистохимических способов, мы обнаруживаем их явную зависимость от кислотно-основных свойств среды, а это уже указывает на сложный характер изучаемых методов окрашивания клеток. Наряду с кальцием, с аскорбиновой кислотой нитрат серебра способен окрашивать ядрышковый организатор.

Крупное ядрышко это важнейший цитологический признак гипертрофии или рака. В настоящее время признано фундаментальное морфологическое значение дифференциального выявление ядрышка и рибосом основанное на окрашивании адсорбционными красителями. Гистохимическое выявление ядрышка и рибосом основано на том, что рибонуклеиновая кислота в силу своих кислотно-основных свойств окрашивается базофильными красителями. Ядерная мембрана, интерфазные хромосомы, ядерный матрикс, ядрышки основные компоненты интерфазного ядра. Количество, размер ядрышек и их важного компонента ядрышкового организатора важнейший показатель в цитологической диагностике заболеваний у человека. Ядрышко часть ядра, где происходит синтез и формирование рибосом, которые затем поступают из ядра в цитоплазму. Ядрышки обнаруживаются в ядре клетке виде плотных гранул. При цитохимическом исследовании установлено, что ядрышко содержит РНК. При электронной микроскопии, 1) гранулярный компонент, 2) фибриллярный компонент (гранулы и фибриллы состоят из рибонуклеопротеидов), 3) связанный с ядрышком хроматин. Было установлено, что ядрышко синтезируется в особом участке хромосом ядрышковом организаторе. При этом Мак Клинток и Хейтц, Навашин обнаружили ядрышковые организаторы в районе вторичных перетяжек хромосом, где они находятся в коротких плечах 13,14,15,21,22 хромосом. Ядрышковый организатор могут сливаться друг с другом в единый агломерат, где образуется одно ядрышко. При электронной микроскопии Фибриллярный центр и ядрышковый организатор построены из ассоциированных фибрилл толщиной 6-19 мкм и обладают способностью –окрашиваться солями серебра это зависит от присутствия особых ядрышковых белков и РНК- полимеразы.

Мы отмечаем сильную кристаллизацию цитологических препаратов бронхоальвеолярного лаважа и мокроты у пациентов с патологией органов дыхания. Ввиду этого мы обратили внимание на ряд гипотез о кристаллической организации ядра высказанную ряд известнейших цитологов ранее. Метод выявления ядрышкового организатора с помощью 50% р-ра нитрата серебра. В настоящий момент известно, что ядерные гены, которые являются ядрышковым организатором, имеют особые кристаллические свойства. По данным Ченцова Ю.С. в 1969 г. открыты кристаллографические свойства ядрышковых генов, выделив ядра тритонов, высолил ядерное вещество, с целью дезинтеграции ядрышек он отделил с помощью ультра-центрифугирования ядрышки, затем изучил под электронным микроскопом изучили препараты, где обнаружили осевые молекулы ДНК, на которых через разные промежутки располагались фибриллярные зоны имеющие вид елочек, длина фрагмента ДНК занятого такой елочкой была постоянной. Структура елочки состояла из стволика образованного 100 гранулярных структур-РНК полимеразы, а так же из тонких нитей, отходящих от «стволика елочки» - которые назвали транскрипты РНК. Далее идет зона спейсеров, которая лишена плотных гранул и нитей. Правильное чередование спейсеров и фибриллярных зон формируют кристаллическую структуру ядрышковых генов. Затем с помощью кристаллографии были изучены белки ядерного матрикса. При изучении белков ядерного матрикса была предложена модель интерфазного ядра, согласно которой белки ядерного матрикса участвуют в пространственной ориентации хроматина. При последовательной обработки изолированных ядер печени крыс в растворе натрия хлорида, а затем ДНК–азой происходит полное растворение хроматина. При этом было обнаружено, что фибриллы хроматина прикреплены к осевым белковым нитям ядерного матрикса наподобие ворсин к палочке в ершике для чистки бутылок. (Ченцов Ю.С., 2004 г.). Мы в своих научных публикациях совместно с В.С. Козловой (2010) подтверждаем идею кристаллографической модели интерфазного ядра предложенную Ченцовым Ю.С. При исследовании эозинофилов в мокроте пациентов бронхиальной астмы мы обнаружили фанероз клеток. При электронной микроскопии обнаруживается упорядоченная сеть белков ядерного матрикса, которые покрыты от которого отходят очень тонкие нити электронно-плотного материала хроматина содержащего ДНК. Функция ядрышковых организатора, определяется регуляцией уровня транскрипции рибосомных генов связана, с такими процессами, как стимуляция, ингибирование роста или дифференцировка клеток. Ингибиторы клеточного роста и индукторы дифференцировки вызывают быстрое подавление транскрипции рДНК, в то время как стимуляторы роста, повышают уровень транскрипции Транскрипция рДНК также регулируется в зависимости от фазы клеточного цикла, прекращаясь в период митоза. (Ченцов Ю.С., 2004). Первичная структура большинства ядерных рецепторов была установлена путем секвенирования их соответствующих кДНК. В структуре всех внутриклеточных рецепторов присутствует ДНК-связывающий домен размером 66-68 аминокислотных остатков, который обнаруживает высокую степень гомологии с другими членами семейства, а также лиганд-связывающий домен (Е) вариабельного размера и низкой степенью гомологии, который определяет специфичность связывания низкомолекулярного регулятора. ДНК-связывающий фрагмент содержит два так называемых «цинковых пальца» (zinc figgers) - петлевидные структуры, образованные остатками цистеина и глицина, соединенными координационными связями с хелат-ионом цинка. Роль «цинковых пальцев» состоит в специфическом распознавании и связывании чувствительного элемента определенного гена, как правило, в главном желобке молекулы ДНК (Laity J.H., Lee B.M., Wright P.E., 2001; Wolfe S.A., Nekludova L., 2000). По этому, нельзя исключать, что «цинковые пальцы», так же могут участвовать в цитохимической реакции на ядрышковый организатор.

Стоит отметить, что при электронной микроскопии лимфоцитов содержащихся в мокроте людей больных патологией мы обнаруживаем выраженную пространственную ориентацию, точнее суперспирализацию хроматина связанного с ядрышком. Пространственная ориентация хроматина является другим важным цитологическим показателем активности синтеза белка в клетке.

В настоящее время предложен ряд методов окрашивания ядрышкового организатора, где реагентом выступает 40-50% раствор азотнокислого серебра. Механизм выявления ядрышкового организатора остается неизвестным, до сих пор. Раствор азотнокислого серебра способен окрашивать ядрышковый организатор, что используется в случае диагностики опухолевых заболеваний (Goodpasture С., Bloom S.E., 1975, Howell, W.M. and Black, D.A., 1980; Херрингтон С., Макги Дж., 1999 г; Бобров И. П., Авдалян А. М., Климачев В. В., и др.2010; Ю.С. Ченцов, 2004). Из биологической жидкости (кровь, назальный секрет, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж и т.д.) или кусочка органа (костный мозг, тимус печень и др.) изготавливается на предметно стекле мазок. Цитологический мазок фиксируется спиртовым фиксатором (метиловый или этиловый спирт). После высыхания мазок покрывается 20 % р-р желатины или желатиноля. На слой желатина наносится 50% водный раствор нитрата серебра. Затем мазок окрашивается 50% р-р нитрата серебра при 50-69 С0 градусах в термостате.

Мы изучали локализацию продукта в препаратах бронхоальвеолярного лаважа пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (Целуйко С.С., 2011). При этом обнаружили, что азотнокислое серебро окрашивает ядрышковые организаторы, а так же другие структуры. Диффузно окрашивалась цитоплазма и ядро клеток цилиндрического эпителия, а так же голые ядра, которые появляются в результате цитолиза. В то же время при цитологическом исследовании препаратов бронхоальвеолярного лаважа отмечается выраженная базофилия эпителиальных клеток и пикноз голых ядер. Гранулярно окрашивалась цитоплазма макрофагов, а так же части клеток цилиндрического бронхиального эпителия.

Это говорит, о том, что импрегнация нитратом серебра является неспецифическим процессом, кроме того, она не устойчива к отмыванию в гипосульфите. Нельзя исключать, то, что нитрат серебра неспецифически осаждается:

1) на ряде ядерных структур, функция которых ассоциирована с ядерными генами.

2) на митохондриях

3) окрашивает включения ионов кальция, или цинка в клетках

4) окрашивает места локализации аскорбиновой кислоты в цитоплазме клеток.

5) осаждается на поверхности нанобактерий, или других микроорганизмах отлагающих во внешнюю среду соли кальция.

6) окрашивает места локализации в клетке биофлавоноидов.

Учитывая то, что биофлавоноиды способны связывать путем образования хелатных соединений, ионы металлов, мы считаем, что Реакция Жиру Леблона и фон Коса обусловлена присутствием биофлавоноидов в клетке.

1   2   3   4   5   6

Похожие:

Целуйко С. С., Зиновьев С. В icon Аффективные нарушения при расстройствах шизофренного круга и возможности поддерживающей терапии
Зиновьев Сергей Владимирович, заместитель главного врача гуз пнд №3 г. Санкт-Петербурга, кандидат медицинских наук
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
edushk.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов