Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология




Скачать 337.59 Kb.
Название Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
страница 1/4
Дата публикации 11.07.2016
Размер 337.59 Kb.
Тип Автореферат
edushk.ru > Биология > Автореферат
  1   2   3   4





На правах рукописи


ВОЙТОВА

КСЕНИЯ ВАСИЛЬЕВНА

ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ


      1. – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Новосибирск – 2011

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.


Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор
Глотов Александр Гаврилович



Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор
Храмцов Виктор Викторович,





кандидат ветеринарных наук
^ Зайцев Юрий Николаевич


Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследова-тельский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук







Защита состоится « 24 » мая 2011 г. в «12-00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348–44–62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.


Автореферат разослан «___» ________ 2011 г.




Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Респираторные болезни являются важной причиной экономического ущерба в молочном скотоводстве. Они приводят к падежу или снижению скорости роста животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия (Н.Н. Крюков и соавт., 1976; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; О.Г. Петрова и соавт., 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; D.G. Bryson, 2000; K.A. Brogden et al., 2002).

Одним из этиологических агентов респираторных болезней является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота (РСИ КРС) регистрируется во всех странах мира с интенсивным типом ведения животноводства (M. Elvander, 1996; L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; A.F. Antonis et al., 2010; B.W. Brodersen, 2010; C. Luzzago et al., 2010). Первые сообщения о ней в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976), А.В. Васильева и соавт. (1988), И.Я. Строгановой (1989), Т.М. Кочиш (2004), И.Н. Матвеевой (2008) и других исследователей.

В настоящее время актуальным является изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в хозяйствах по производству молока, особенно с наличием импортированного скота, а также разработка эффективных методов диагностики болезни с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий.

Вирусологическая диагностика болезни малоэффективна, поэтому преимущество имеют молекулярные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (E.J. Dubovi, 1993; J.-F. Valarcher et al., 2007). Разработка ОТ-ПЦР для выявления РСВ КРС во многих странах началась в конце прошлого столетия. В литературе имеются сообщения о выявлении вируса в пробах биоматериала от больных животных (S. Vilcek et al., 1994; L.E. Larsen et al., 1999; V. Valentová et al., 2003; R.S. Almeida et al., 2005; M. Boxus et al., 2005; J.-F. Valarcher et al., 2007; E. Timsit et al., 2009; O. Angen et al., 2009).

На момент начала наших исследований в РФ законченных разработок в этом направлении не было.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка полимеразной цепной реакции для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение ее диагностической и экономической эффективности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири с учетом наличия в них импортированного и местного скота по результатам серологических исследований;

2. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ОТ-ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также – влияние сроков хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах на пригодность к исследованию в ОТ-ПЦР;

3. Изучить диагностическую и экономическую эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях, установить частоту выявления РСВ в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Научная новизна. Показано широкое распространение РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. Разработана ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F, показана ее высокая эффективность при диагностике болезни в производственных условиях. Определены оптимальные сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования ОТ-ПЦР в диагностике РСИ КРС в качестве основного вирусологического метода в комплексе с серологическими исследованиями, что будет способствовать оптимизации противоэпизоотических мероприятий.

Материалы диссертации представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли РСВ в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций: «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.)

Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на: международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИиТИБП, «Научные основы производства биологических препаратов», Щелково, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; XIV международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов  «Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России», посвященной 80-летию УГАВМ, Троицк, 2009; VI международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии, «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010; XIII международной научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Новосибирск, 2010; VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010 г.

^ Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована одним рисунком и 10 таблицами. Список литературы включает 246 источников, в том числе 188 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты изучения распространения и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него;

2. Результаты разработки и изучения эффективности полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для диагностики РСИ КРС в производственных условиях.

^ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008–2011 гг. в лаборатории биотехнологии – диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

^ Изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в Сибири. В связи с тем, что плановые исследования на вирусные инфекции не предусмотрены нормативной документацией, при изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований.

Исследовали 538 проб сыворотки крови от телят до 6-месячного возраста, 584 пробы от нетелей, телок и коров. Постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) проводили с помощью набора для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (ООО «Агровет», Москва).

При изучении распространения болезни использовали серологический метод. Исследовали пробы сыворотки крови, отобранные от животных однократно. Высчитывали средний процент проб, содержащих антитела к вирусу, от числа поступивших из хозяйств с наличием или отсутствием вспышек респираторных болезней.

С целью установления сероконверсии к вирусу, свидетельствующей об его активной циркуляции, исследовали парные пробы сыворотки крови телят, нетелей и коров, отобранные с интервалом 30 дней. Полученные пробы хранили при минус 20ºС и исследовали одновременно.

Исследования проводили в 27 хозяйствах трех регионов Сибири: Тюменской и Новосибирской областей и Красноярского края с наличием или отсутствием импортного скота.

^ Праймеры для ОТ-ПЦР. Поиск праймеров осуществляли на основе анализа полного генома штамма РСВ КРС А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения “Lasergen”, Alignment-serves и CLUSTAL. Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F, обладающего высокой консервативностью. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе “Vector NTI Suitе” с последовательностями генома вируса парагриппа-3 (ПГ-3) КРС.

Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик». Продукты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор-UVT-1». Положительными считались пробы, дающие полосу фрагмента кДНК, соответствующую 381 п.н. Исследования проводили в трех повторностях.

^ Штаммы и изоляты вирусов. В работе использовали два штамма РСВ КРС: РС-Б № 3, представленный проф. Красочко П.А., и К-18, выделенный в ГНУ ИЭВСиДВ.

В опытах по изучению специфичности ОТ-ПЦР дополнительно использовали вирус ПГ-3 (штамм ПТК), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (штамм ВК-1), вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм), герпесвирус КРС 1-го типа (штамм Оренбург), аденовирус КРС 1 типа (штамм BV-10), риновирус КРС 1-го типа (штамм SD-1), неинфицированные культуры клеток Vero и ТЭБ.

^ Выделение РНК и получение кДНК вируса. Выделение РНК вируса осуществляли стандартным способом с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили при помощи коммерческого набора «Реверта-L» производства того же института. В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [pH 8.3], 3 мМ MgCl2, 75 mM KC1, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ), и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат при 37ºС на 30 минут. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ОТ-ПЦР.

^ Проверка чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР. Для определения чувствительности реакции контрольный штамм вируса РСБ № 3 титровали методом 10-кратных разведений до 10–7 ТЦД50/мл, каждое разведение исследовали в ОТ-ПЦР. Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами.

Для изучения эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях исследовали 273 пробы биоматериала. В том числе: 45 проб носовых выделений, 24 – трахеального и бронхиального экссудатов, 180 – бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы биоматериала транспортировали в лабораторию в замороженном состоянии или в транспортной среде в течение не более 24 часов с момента их отбора. При отсутствии возможности доставки проб в течение указанного срока, их замораживали однократно и транспортировали в лабораторию в термосе со льдом.

Пробы органов и тканей перед исследованием растирали в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10%-ые суспензии на физиологическом растворе, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученные суспензии исследовали в ОТ-ПЦР. Смесь переносили в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветленного супернатанта. Густые пробы носовых выделений и экссудата разводили стерильным физиологическим раствором (примерно 1:5). Полученную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.

^ Изучение влияния сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР. Полученные суспензии внутренних органов, а также выделенной РНК, фасовали в пластиковые пробирки, помещали на длительное хранение при плюс 4ºС и минус 18ºС. Срок наблюдения составлял 12 месяцев. Через каждые 30 дней пробы извлекали и подвергали исследованию в ОТ-ПЦР.
  1   2   3   4

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Рассмотрение проблемы некробактериоза с позиции теории эпизоотического процесса
После прочтения статьи В. А. и А. В. Мищенко «Болезни конечностей у высокопродуктивных коров», опубликованной в журнале «Ветеринарная...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Фундаментальные знания эпизоотического процесса основа контроля туберкулеза...

Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon УСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Особенности проявления диагностических реакций у крупного рогатого...
Работа выполнена в гну институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока со россельхозакадемии
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек...
...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Мы живём в сельской местности и с ранних лет мы помогаем своим родителям...
«Рентабельность содержания крупно – рогатого скота в домашнем хозяйстве». Выбранная тема показалась нам актуальной, потому что многие...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Парагрипп крупного рогатого скота
В хозяйствах ряда районов заболевание телят парагриппом не только не снизилось, но и приобрело стационарный характер. Нелишне будет...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon О проблемах контроля эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота
Вернуться к этой теме заставили публикации в «ВК» №15 и №19 за 2006 год Л. Г. Белова и В. Л. Никифоровой «Ретроспективный взгляд...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Вопросы экзаменационных билетов по педиатрии
Внутриутробные инфекции: классификация. Этиология, патогенез, клинические проявления, диагностика, терапия и профилактика врожденной...
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon Проекта
Рентабельность содержания крупно рогатого скота в домашнем хозяйстве. Математика и сельское хозяйство
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
edushk.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов