Цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам
|
Скачать 458.57 Kb.
|
На правах рукописиЗавьялова Елена Александровна Цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам 03.00.23 – биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2006 Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ им.Я.Р.Коваленко) Научные руководители: Кандидат ветеринарных наук, в.н.с. ^ Заслуженный деятель науки РФ, Доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук ^ (ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко) Кандидат биологических наук, доцент Кондратьева Ирина Анатольевна (Международный биотехнологический центр ^ Ведущая организация – Московская государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина Защита диссертации состоится « » 2006 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект 24, к.1, ВИЭВ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ Автореферат разослан « »__________________ 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Н.П.Овдиенко ^ Актуальность проблемы. Метод культивирования клеток вне организма является большим достижением биологической науки, так как позволяет получать наиболее объективные и надежные данные при диагностике вирусных инфекций, использовать их в биотехнологических процессах при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител. (Wolf K. et.al., 1980; Sasson A., 1987; Животная клетка в культуре, 2000). Культуры клеток рыб также являются объектом биотехнологии и вирусологии. Наибольшую потенцию роста in vitro имеют клетки гонад неполовозрелых рыб и их эмбрионы (Dannevig B.H. et.al., 1997), культуры, приготовленные из зрелых тканей, обладают слабой потенцией роста (Miller N.W. et.al., 1994a; Rode M. et. al., 1997; Wergeland H.I. et.al., 2001). В некоторых случаях перевиваемые культуры клеток получены из новообразований: саркомы, лимфосаркомы, гепатомы, нефробластомы и оспенной эпителиомы (Soustegard R.A. & Soustegard K.S., 1973; Fijan N., Sulimanovic D. et. al., 1983). Благодаря получению однослойных культур клеток гонад карпа в нашей стране впервые в 1970 году был выделен вирус от больных карпов, а при изучении свойств и роли вируса в патологии рыб установили, что этот агент вызывает заболевание названное весенняя вирусная болезнь карпа (Рудиков Н.И., 1986). В 2001 году впервые в России от мальков семги, полученных из оплодотворенной икры, завезенной из Норвегии, в культуре клеток сердца кеты был выделен вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых, представитель семейства Birnaviridae (Пичугина Т.Д. с соавт., 2005а). Таким образом, с возникновением острых вирусных эпизоотий среди карповых и лососевых рыб, появилась необходимость в совершенствовании методов диагностики, основанных на использовании как первичных, так и перевиваемых культур клеток. В практической вирусологической работе наиболее важным является изучение спектра чувствительности культур клеток к различным вирусам (Kelly R.K. et.al., 1978; Kielian M. et.al., 1990). Не все линии клеток изучены достаточно полно в этом отношении. Так, в культуре клеток FHM реплицируются, по крайней мере, четыре вируса рыб - IPNV, SVCV, VHSV, IHN и два вируса теплокровных животных (Gravell M. et.al., 1965). Культура клеток CHSE – 214, из эмбрионов чавычи, чувствительна к вирусам герпеса лососевых, IHN, IPN и VHS (Kibenge F.S.B. et.al., 2000). Культура клеток из оспенных поражений карпа ЕРС также имеет широкий спектр чувствительности и в ней реплицируются вирусы SVC, VНS, а также вирусы европейского угря. Особый интерес представляет линия клеток радужной форели RTG–2, чувствительная к шести вирусам рыб, а также к вирусам венесуэльского и восточного энцефаломиелитов лошадей, и отека головастиков (Hjalmarsson A. et.al., 1999). Однако, несмотря на существование большого количества перевиваемых клеточных линий рыб не все из них могут быть использованы в диагностике. Для областных и районных диагностических лабораторий зачастую не представляется возможным и экономически оправданным приобретение из-за рубежа или исследовательских институтов необходимых линий клеток. Более того, работа с зарубежными культурами клеток рыб сопряжена с определенными трудностями при культивировании. В качестве альтернативы при диагностических исследованиях для выделения и накопления вируса возможно использование первичных культур и субкультур клеток, полученных из тканей восприимчивых к данному вирусу рыб (Office International des Epizooties, 2000). Таким образом, расширение исследований по получению первичных культур клеток и субкультур, чувствительных к определенным вирусам рыб, и создание в дальнейшем отечественных постоянных линий является актуальной научной проблемой. Цель работы: изучить культурально-морфологические свойства первичных культур клеток, субкультур и клеток перевиваемых линий из тканей различных видов рыб и определить чувствительность к вирусам-возбудителям инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC). ^
Научная новизна Получены субкультуры клеток из первичных культур клеток гонад радужной форели и серебряного карася, дана их цитоморфологическая характеристика и определена чувствительность к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC) соответственно. Получена и адаптирована для размножения вируса весенней виремии карпов (SVC) субкультура из клеток эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи. Отработана схема перевода непермиссивных клеток эпителиальной паппиломы карпа в состояние пермиссивности по отношению к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN). Практическая ценность работы заключается в том, что в результате проведенных исследований отработаны методы получения первичных культур и субкультур из внутренних органов и гонад радужной форели, гонад карася и эмбрионов гуппи, чувствительных к вирусам лососевых и карповых рыб и показана возможность использования их в вирусологических исследованиях. Апробация Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на: Заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2003г.); Конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (ВИЭВ, 2003г.); Second Bilateral Conference «Aquatic & marine animal health» (USA, 2003); Совещании, посвященном научно-практическим проблемам инфекционной патологии и охраны здоровья рыб, (ВИЭВ, 2004г.); Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов». (Санкт-Петербург, 2004г.); Конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (ВИЭВ, 2005г.); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.); Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.) Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ. Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на 131 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 178 публикаций, в том числе 147 иностранных. ^ Работа выполнена в 2002 - 2006 гг. в лаборатории ихтиопатологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в рамках задания 02.01.18 РНТП «Изучить эпизоотическое состояние рыбоводческих хозяйств по вирусным и бактериальным инфекциям, взаимодействие инфекционных агентов с различными видами тканевых культур». ^ 1.1. Рыбы. В опытах по приготовлению первично-трипсинизированных культур клеток было вскрыто 16 экземпляров радужной форели (Salmo irideus Gibbons) средней штучной массой 500 г, 44 экземпляра серебряного карася (Carassius carassius L.) средней штучной массой 200 г и 27 экз. самок аквариумной рыбы-гуппи (Lebistes reticulates L.) средней массой – 2,5-3г. Работу проводили согласно методам, изложенным в руководстве «Животная клетка в культуре», 2000. 1^ ок. В работе с культурами использовали стандартные питательные среды и растворы: ИГЛА МЕМ, ИГЛА МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов, 0,02% раствор версена (ЭДТА), 0,25% раствор трипсина, фетальная телячья сыворотка, раствор Хенкса, антибиотики (гентамицин, канамицин, пенициллин, ампиокс и т.п.), 0,05% раствор трипанового синего, 0,1% раствор кристаллвиолета, метиловый спирт или этиловый абсолютный, уксусная кислота, готовый краситель по Романовскому-Гимза, ксилол, бальзам кедровый. Для изучения морфологических изменений в культурах клеток использовали зарубежные перевиваемые линии клеток, любезно предоставленные с.н.с. лаборатории ихтиопатологии ВНИИПРХ Щелкуновым И.С.: CHSE–214 (Нормальный эмбрион чавычи, Oncorhynchus tshawytscha Walbaum), CHH-1 (Сердце кеты, Onchorynchus keta Walbaum), ЕРС – (Эпителиальная папиллома карпа, Cyprinus carpio L.). Культуры клеток поддерживали путем периодического пассирования. Пересев осуществляли по мере формирования монослоя бесцентрифужным методом смесью 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 (CHH-1), 1:2 (CHSE – 214), коэффициент пересева 1:2 – 1:3, температура инкубации 15-16оС. Монослой культуры ЕРС снимали с поверхности роста 0,02% раствором версена, коэффициент пересева 1:2 – 1:5, температура инкубации 22-23оС. ^ . Для приготовления цитологических препаратов клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Объем суспензии 1,5-2,0 мл. Клетки фиксировали смесью этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1) или абсолютным этиловым спиртом, и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. 1.3. Вирусы. Вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV) европейский референтный штамм был любезно предоставлен д-ром Erke Neuvonen, (НИИ ветеринарии и продовольствия Хельсинки). Полевой штамм вируса инфекционного некроза поджелудочной железы, выделенный сотрудниками лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко в 2001 году от мальков семги в одном из рыбоводческих хозяйств Мурманской области, названный ВС-1. (Pichugina T.D. et al., 2003; Пичугина Т.Д. с соавт., 2005a). Вирус весенней виремии карпа (SVCV), отечественный референтный штамм «ЗЛ4», изолированный в 1991 году от годовиков карпа в рыбоводческом хозяйстве «Заветы Ленина», Краснодарского края, был любезно предоставлен И.С.Щелкуновым, (ВНИИПРХ). ^ Готовили 10-кратные разведения вируса на питательной среде (Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов без сыворотки). Учет цитопатогенного действия проводили микроскопированием зараженных культур, начиная с 5 часов после инокуляции и до 5-7 дней включительно. Титр вирусов определяли по методу статистического учета Reed L.J., Muench H. A. (1938) и выражали в тканевых цитопатогенных дозах в 1 мл (ТЦД50/мл). Результаты исследований обрабатывали методом математической статистики (Лакин Г.Ф. 1990). ^ 2.1. Разработка методов получения первичных и субкультур клеток из тканей лососевых рыб (Salmo irideus Gibbons) и их цитоморфологическая характеристика Одной из задач наших исследований было разработать оптимальные методы дезагрегации ткани с выходом большего количества клеток для выращивания первичных культур и их субкультивирования. В исследованиях по получению первично-трипсинизированных культур клеток из внутренних органов форели установлено, что для каждого органа предпочтителен определенный режим дезагрегации, позволяющий получить наибольшее количество жизнеспособных клеток. ^ Поставлено 4 опыта. В экспериментах использовали трипсин рН 7,4-7,5; версен и их смесь. В первом варианте измельчённые ткани заливали 0,25% раствором трипсина, во втором - 0,02% раствором версена, в третьем варианте смесью 0,02 %-ного раствора версена и 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:1, в четвертом - в соотношении 2:5. Результаты опытов по дезагрегации ткани сердца форели представлены в таблице 1. ^
Из таблицы видно, что применение 0,25% раствора трипсина сильно травмирует клетки, жизнеспособность очень низкая (32,3 – 22,3%). Применение 0,02% раствора версена дает небольшой выход клеток с низкой жизнеспособностью, возможно из-за длительности дезагрегации. Дезагрегация по третьему и четвертому варианту давала сопоставимые значения жизнеспособности (69,9% и 65,1%), но использование смеси версен+трипсин как 2:5 позволило получить больший выход клеток 317,0 тыс.кл/мл. Оптимальные результаты получены при дезагрегации ткани пятью циклами по 30 минут с использованием смеси 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 2:5. Для культивирования использовали среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов с 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глютамином (300 мг/мл). Посевная концентрация около 600 тыс. клеток в 1 мл среды. Анализ цитологических препаратов показал, что клетки сердца форели (СФ) образуют монослой в течение 3-4 месяцев (рис.1). Клетки в основном эпителиоподобного типа, полигональной формы. В ядрах содержится 1-3 ядрышка. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 |
Вопросы Анализаторы человека и их свойства: чувствительность, адаптация,... Лекция №4 Краткая характеристика нервной системы, анализаторов человека и анализаторов систем |
 |
" я сегодня другой, чем вчера", сказал поэт, а что на этот счет думает наука. Клетки организма «электрические провода», по которым передаются нервные импульсы. Их размеры колеблются от 0,01 мм у нервных клеток (нейронов) до... |
 |
Большинство любителей и не подозревают, какое богатство представляют... Большинство любителей и не подозревают, какое богатство представляют собой многие виды отечественных рыб. Приобрести адаптированных... |
|
У опасной черты Но далеко не все люди знают, что сейчас заканчивается двухтысячелетие эпоха Рыб. В 2003 году наступает эпоха Водолея. Земля, переходя... |
|
Роль минеральных элементов в организме человека Системы саморегуляции действуют не только на уровне организма, но и на уровне клеток. Организм является суммой составляющих его клеток,... |
|
Рабочая программа составлена на основе: Программ общеобразовательных... Основы религиозных культур и светской этики Данилюк А. Я – М.: Просвещение, 2013 |
|
Нормативными правовыми основами разработки и введения комплексного... «Введение нового курса «Основы религиозных культур и светской этики» в четвертых классах в 2012-2013 учебном году» |
|
«Основы религиозных культур и светской этики» Информация для родителей об особенностях курса «Основы религиозных культур и светской этики» |
|
Информация для родителей по орксэ основы религиозных культур и светской этики Пр-2009 и Распоряжения Правительства Российской Федерации от 28 января 2012 г. №84-р с 1 сентября 2012 года во всех общеобразовательных... |
|
Учебный курс «Основы религиозных культур и светской этики» «Основы религиозных культур и светской этики» (далее по тексту-Положение) регламентирует порядок организации преподавания учебного... |